자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로
Summary
현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.
Abstract
암 세포 이동성은 전이의 개시에 대 한 중요 합니다. 따라서, 셀 이동 및 침략 적 능력의 큰 의미입니다. 마이그레이션 분석 침공 분석 실험은 더 순수 관련, 원래 사이트에서 vivo에서 암 세포 dislodgment를 흉내 낸 고 세포 외 매트릭스를 통해 침입 하는 반면 2D 수준에서 셀 이동의 기본적인 통찰력을 제공 합니다. 현재 프로토콜 마이그레이션 및 침입 분석 실험에 대 한 단일 워크플로우를 제공합니다. 실시간 HD 이미지와 내장 된 분석 모듈에 대 한 통합된 자동화 된 미세한 카메라를 함께 연구 한 시간 효율, 간단 하 고 재현성 실험 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 선택할 다른 분석 방법과 소모품에 대 한 대체도 포함 됩니다.
Introduction
셀 이동 및 침략 상처 폐쇄, 자 궁과 유선 morphogenesis1,2,3태의 침공 등 인체의 정상적인 기능을 사용할 수 있는 중요 한 생물 학적 과정이 있습니다. 인간의 몸은 이러한 생물 학적 이벤트;의 정확 하 고 엄격한 통제 그러나, 몇 가지 예외가 있다. 악성 종양, 예를 들어이 보호를 탈출, 비정상적인 증식을 전시 전 이라고 인접 조직으로 침범을 수 있습니다. 전이 암 관련 사망률4의 주요 원인입니다.
유방암은 가장 일반적으로 여성, 암 진단 이며 여성 암 관련 된 죽음의 두 번째로 높은 원인이 선진국 전세계5. 유 방 암 덕트 또는 lobules 상피 세포의 하나 이상의 계층으로 구성 된에서 유래 했다. 정상적인 유 방 상피 세포 서로 전자 cadherin 및 integrins6같은 막 단백질을 통해 지하실 막에 준수합니다. 그러나, 침 습 유방암 세포 그들의 극성 및 세포 세포 접착, 잃 었 고전적인 상피 엽 전환 (응급)를 받아야 하 고 이동 하는 기능을 얻을. 넘쳐 흐름, 후이 세포는 세포 외 기질 (ECM)에 걸쳐 이동 하 고 혈관 또는 임 파 액 체계, intravasation 및 전이성 성장7다음 다음을 입력 합니다. 큰 의미는이 발생 하는 메커니즘을 이해, 때문에 전이 암 관련 mortalities의 가장 흔한 원인은 암 밀접 하 게 관련 된 세포 마이그레이션/침공. 암 세포의 움직임을 시각화, 마이그레이션 및 침입 분석 실험 이상적인 모델을 각각 2D 및 3D 셀 운동, 공부는. 마이그레이션 침공은 microenvironment와 생물 학적 장벽을 저하 능력 상호 작용을 포함 하는 반면 세포의 움직임을 직접 평가 합니다. 마이그레이션 침공의 요구 사항으로 두 개의 프로세스가 서로 완전히 독립적 되지 않습니다.
여러 가지 방법은 마이그레이션 침공을 공부 하 고 개발 되었습니다. 울타리와 마이크로 캐리어 분석 영역;의 변화 평가를, 셀 수 있도록 셀 무료 영역 생성 Kramer 연구진이, 상처 치유, 같은 마이그레이션 분석 검토 반면, transwell 및 모 세관 분석 유인8쪽으로 이동 하는 셀의 수를 기반으로 합니다. 침공 분석 실험, 대 한 ECM 환경 예를 들어, ECM 젤 또는 콜라겐 설정할 수 있으며 3D 이동 침공 지역, 거리 및 셀 수 (예: transwell 분석 결과, 오리너구리 분석 결과)를 모니터링 하 여 평가 될 수 있다8. 비-침략 적 세포로 침입 셀을 결합 하 고 침입 세포의 행동을 평가 하는 것입니다 침공 분석 결과의 다른 유형 (예: 회전 타원 체 분석 실험). 위의 방법은 그들의 프로 죄수, 그리고 쉽게 접근, 쉽게, 반복 하 고 마이그레이션 분석 결과 결합 하는 방식으로 있고 비슷한 워크플로 분석 결과 침공은 실험적인 디자인에 우선.
이 프로토콜 셀 마이그레이션 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 침입의 측정을 설명 합니다. 그것은 표준 셀 문화 인큐베이터에 설치 하는 시스템을 모니터링 하는 실시간 셀입니다. 그것은 높은 정의 이미지 검색과 간격 측정 셀 또는 형광 목표에 적절 한 마스크를 적용 하 여 설정에 따라 걸립니다. 분석 결과 마이그레이션/침략의 모듈 96 잘 접시에 셀 단층에 균질 스크래치 상처를 만들기에 적합은 96 핀 스크래치 도구 사용 하 여 포함 되어 있습니다. 메커니즘은 생체 외에서 상처 치유 분석 실험, 플라스틱 또는 코팅된 표면에 2D 셀 이동 모니터링을 기반으로 합니다. 침공 또는 스크래치 상처 내 추가 ECM에 걸쳐 3D 이동 평가 수 있습니다. 간단한 워크플로 그림 1에 나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마이그레이션 및 침략 암 세포의 이동성을 평가 하기 위해 중요 한 매개 변수가 있습니다. 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 2D 및 3D에서 분석 실험을 동시에 치유 하는 상처를 수행 가능 하다. 자동 스캐닝을 촉진, 떨어져 최소 중단, 안정적인 셀 문화 환경을 제공 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 실시 하는 스크래치 분석 결과 제공 일관 된 스크래치 상처, 더 강력한 실험을 사용 하 고 재현 가능….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 사냥꾼 의료 연구 연구소 (13-02 HMRI)를 통해 블 룸 필드 그룹 재단 자금 지원 하 고 싶습니다. X.Z는 뉴캐슬의 대학 통해 APA 장학금 및 HCRA Biomarkers 주력 박사 장학금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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