Method Article

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale

DOI:

10.3791/59043

⸱

April 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

In This Article

Summary

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Le protocole introduit ici permet la caractérisation de la capacité de radioralliement pulmonaire des lymphocytes humains primaires dans des conditions inflammatoires in vivo. Une infiltration pulmonaire des cellules immunitaires humaines moutschen transférés dans un modèle murin d’inflammation allergique peut être imagée et quantifiée par microscopie à fluorescence lumière-feuille de tissu pulmonaire chimiquement défrichées.

Abstract

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Accumulation dans les tissus de cellules immunitaires activées hautement représente une caractéristique de diverses maladies inflammatoires chroniques et a émergé comme une cible thérapeutique séduisante dans la prise en charge clinique des patients affectés. Afin d’optimiser les stratégies visant à un règlement thérapeutique de l’infiltration des tissus pathologiquement déséquilibrée des cellules immunitaires pro-inflammatoires, il sera particulièrement important pour atteindre les aperçus améliorés en maladie et organe-spécifiques propriétés homing des lymphocytes périphériques. Le protocole expérimental décrit ici permet de contrôler l’accumulation des lymphocytes humains fluorescent étiquetés et moutschen transférés dans le cadre d’une inflammation pulmonaire induite par la papaïne poumon. Contrairement aux tests in vitro standards fréquemment utilisés pour l’analyse de la migration des cellules immunitaires et la chimiotaxie, le paramètre in vivo maintenant introduit tienne compte des aspects spécifiques du poumon d’organisation tissulaire et l’influence du complexe inflammatoire scénario qui se déroulent dans l’organisme murine vivant. En outre, imagerie microscopique en trois dimensions transversales lumière-feuille fluorescence ne fournit pas uniquement des données quantitatives sur l’infiltration de cellules immunitaires, mais représente aussi le modèle de la localisation des cellules immunitaires dans l’inflammation pulmonaire. Dans l’ensemble, nous sommes en mesure de présenter une technique innovante de haute valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des pneumopathies inflammatoire chronique, qui peut être facilement appliqué en suivant le protocole étape par étape fourni.

Introduction

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Troubles inflammatoires classiques du poumon, telles que l’asthme allergique et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), sont bien connus pour être chassés par un augmentation du recrutement des lymphocytes activés dans le tissu pulmonaire1,2. Les cytokines lymphocytes-réalisé (par exemple, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ et TNF-α) promouvoir davantage le chimiotactisme des cellules immunitaires innées et adaptatives, induire de remodelage des voies aériennes fibreuses ou endommager directement le poumon parenchyme2. Jusqu'à présent, les mécanismes sous-jacents responsables de....

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Protocol

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Dans les expériences impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par les autorités locales compétentes à Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne). Souris ont été logés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. La collecte de sang humain a été approuvée par le comité local d’éthique et de la Commission de révision institutionnelle de l’Université d’Erlangen-Nuremberg. Chaque patient a donné consentement éclairé.

1. provoquer l’Inflammation pulmonaire allergique chez la souris

Remarque : Comme décrit dans les précédente....

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Results

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Le protocole présenté décrit un modèle expérimental de souris, qui permet la surveillance et quantification de l’accumulation de moutschen transféré les lymphocytes T humains dans les poumons par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille. Figure 1 A fournit un aperçu schématique des étapes de la planification expérimentale in vivo. Afin de garantir des résultats fiables, il est d’une importance essentielle pour assurer une bonne qualité de l’isolement.......

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Discussion

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Le paramètre expérimental décrit ici offre la possibilité de contrôler la capacité de radioralliement pulmonaire des principales cellules immunitaires humaines sous des conditions inflammatoires in vivo et donc pertinente compléments classiquement effectuée chimiotactisme et adhérence in vitro dosages. Pour prendre en compte les caractéristiques spécifiques organe anatomique du poumon, des aspects importants de cellules immunitaires d’autoguidage (incluant la distribution de chimiotactisme et.......

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Disclosures

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M.F. Neurath a servi comme conseiller pour Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda et Boehringer. Les autres auteurs ne pas divulguer tout conflit.

Acknowledgements

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Les auteurs remercient financement par la DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 et 241 de la TRR. L’Optical Imaging Centre Erlangen (OICE) et en particulier Ralf Palmisano, Philipp Tripal et Tina Fraaß (projet Z2 de la DFG CRC 1181) sont reconnus pour un soutien technique spécialisé pour l’imagerie microscopique de fluorescence lumière-feuille.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne2267.4
AlexaFlour594 anticorps anti-CD45 humainBioLegend, San Diego, États-Unis304060
Chlorure d’ammoniumCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AllemagneCanule K2981
21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis301300
Colorant pour prolifération cellulaire eflour670eBioscience Inc., San Diego, États-Unis65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne8043.1
Tube de prélèvement sanguin de potassium-EDTA, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne112372-100G
Éthanol &ge ; 99.5 % (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne5054.3
FBS (sérum de bovin fœtal) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, AllemagneP40-47500
Filtre 100 µ ; m  ;VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Allemagne732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurich, Suissen.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ; ttingen, Allemagnen.a.Ketamin
  ;Inresa Arzneimittel GmbH, Fribourg, Allemagne3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Allemagnen.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-042-303
Canule Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne851638035 Aiguille 30
GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesse, Allemagne9161502
Neubauer chambre de comptageneoLab Migge GmbH, Heidelberg, AllemagneC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü ; sseldorf, AllemagnePSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-042-401
Milieu de séparation des lymphocytes (densité 1 077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1 071 440 025
PBS Dulbecco (solution saline tamponnée au phosphate)Biochrom GmbH, Berlin, AllemagneL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4BioLegend, San Diego, États-Unis317428
PerCP/Cy5.5 souris IgG2b, isotype &kappa ; CtrlBioLegend, San Diego, États-Unis400337
PFA (paraformaldéhyde)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Allemagne0335.1
Hydrogénocarbonate de potassiumCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AllemagneP7481
Pipette sérologique 10 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne86.1254.001  ;
Seringue 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hesse, Allemagne9166017V
Seringue 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis260067
Seringue 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, États-Unis260069
Tube 1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72 706 400
Tube 2 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72.695.400  ;
Tube de 2 mL, brunSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne72 695 001
Tube 15 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne62.554.502  ;
Tube 50 mLSarstedt AG & Co., Nü ; mbrecht, Allemagne62.547.254  ;
Séparateur QuadroMACSMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Allemagne130-090-976
Xylazin (Rompun 2 %)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, AllemagneKPOBD32

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma ....

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