פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.
מהמם הצטברות רקמה של תאים חיסוניים מופעל מאוד מייצג סימן היכר של מחלות דלקתיות כרוניות שונות, הגיח יעד אטרקטיבי טיפולית בתחום ניהול קליני של חולים מושפעת. כדי לייעל עוד יותר אסטרטגיות מכוון טיפולית רגולציה של רקמות באופן פתולוגי מאוזנת חדירה של תאים חיסוניים הפרו דלקתיים, זה יהיה בעל חשיבות מיוחדת כדי להשיג שיפור תובנות לתוך המחלה איברים ספציפיים או תכונות ביות של לימפוציטים היקפיים. פרוטוקול הניסוי המתואר כאן מאפשר לעקוב אחר ריאות הצטברות של לימפוציטים אנושיים fluorescently שכותרתו, הועבר adoptively בהקשר של דלקת ריאות הנגרמת פפאין. בניגוד מבחני הפריה רגילה תכוף לניתוח של נדידת תאים חיסוניים ו כימוטקסיס, ההגדרה ויוו עכשיו הציג לוקח בחשבון ספציפי ריאות היבטי בארגון רקמות ואת ההשפעה של המתחם דלקתיות תרחיש מתרחשים האורגניזם החי מאתר. יתר על כן, קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך תלת מימדי הדמיה מיקרוסקופיים אינם מספקים נתונים כמותיים על הסתננות התאים החיסוניים, אבל גם מציג את הדפוס של תאים חיסוניים לוקליזציה בתוך הריאה מודלק. בסך הכל, אנו מסוגלים להכיר טכניקה חדשנית בעלת ערך גבוה עבור אימונולוגי במחקר בתחום מחלות ריאה דלקתיות כרוניות, אשר יכול להיות מיושם בקלות על ידי ביצוע פרוטוקול צעד אחר צעד שסופקו.
הפרעות דלקתיות קלאסי של הריאות, כגון אסטמה אלרגית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ידועים היטב כדי להיות מונע על ידי גיוס מוגבר לימפוציטים מופעל לתוך רקמת הריאה1,2. ציטוקינים שפורסמו לימפוציטים (למשל, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ ו- TNF-α) לקדם כימוטקסיס של תאים חיסוניים מולדת, גמישים, זירוז שיפוץ שהותירה דרכי הנשימה או ישירות לנזק parenchyma הריאה2. עד כה, המנגנון הבסיסי אחראי הצטברות פתולוגי של לימפוציטים בתוך רקמת הריאה אינם עדיין לגמרי מובנים. בהשוואה כדי החתמה תא T סלקטיבי רקמות המתוארות עבור יונת במעיים, עור, ריאות תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים כמובן פריים היקפיים בתאי T ריאות מועדף חדירה, לפחות חלקית דרך אינדוקציה הביטוי CCR4 על פני השטח של לימפוציטים3. חוץ CCR4, הסתננות דרכי הנשימה תאי T מאופיינים גם ביטוי מוגבר במיוחד של קולטני כימוקין CCR5, CXCR3 לעומת תאי T בתוך4,1,5דם היקפיים. באופן כללי, קיימים נתונים עקביים עם הרעיון כי הריאות יונת של לימפוציטים מסוג T בתנאים פיזיולוגיים או דלקתיים כרוך במספר רצפטורים שונים כימוקין ליגנדים בהתאמה שלהם, ובכך מכרעת תלוי מקרוב נשלט שיתוף פעולה בין תאים חיסוניים מולדת, מסתגלת1. במיוחד, בשלב הראשוני של חשיפה פתוגן או אלרגן, תאים של מערכת החיסון המולדת להגיב TLR גירוי או cross-linking בתיווך IgE על ידי שחרור מיידי של chemoattractants שונים, כמו LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 ו- PGD21,6,7. בתור דוגמה, האינטראקציה בין PGD2 הקולטן chemoattractant CRTh2 ידוע שיש חשיבות מיוחדת עבור כימוטקסיס תאי Th2 והופיע ובכך מבטיח כמו מטרה טיפולית ניהול קליני של אסטמה. אכן, חולי אסטמה מתונה הראה שיפור בסימפטומים, עלייה משמעותית של אמצעי האחסון expiratory בכפייה בשנייה אחת (FEV1) לאחר הטיפול עם אנטגוניסט CRTh2 סלקטיבית לעומת פלסבו קבוצה8 ,9. במצב יותר שהתמשכו של תגובת דלקתית, תאי T וגייסנו כבר מסוגלים להגביר עוד יותר לימפוציטים ריאתי הצטברות באמצעות השחרור של IL-4 ו- IL-13 בתור לגירויים חזק עבור בקרי התחום ריאתי. לאחר מכן, אלו תאים מולדת מיאלואידית נגזר למעלה-לווסת את הביטוי של CCL17, CCL22 STAT6 תלויית האופן1,10,11. למרות המורכבות של התרחיש המתואר מעכבת עדיין הבנה מלאה של תא T ריאות ביות, המלון מציע שפע של מטרות מולקולריות עבור פקד טיפולית פוטנציאל אופטימיזציה של מחלות דלקתיות או אלרגיות. לכן, יש צורך דחוף של טכניקות חדשניות ניסיוני, אשר מסוגלים להעמיק עוד יותר ולהשלים את הידע שלנו בתחום של תא T כימוטקסיס, יונת ריאות.
בשל העובדה כי יונת ריאות של לימפוציטים בתוך גוף האדם מושפע על ידי פרמטרים הסלולר, ההורמונאלית והפיזי מספר1, מרבית השיטות ניסיוני הקיימים אינם מסוגלים דגם כל המורכבות של תהליך אימונולוגי. במקום זאת, רבים פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח של הריאה ביות באופן סלקטיבי להתמקד על היבט מסוים מעורב המפל של לימפוציטים משיכה, הדבקות, העברה ושמירה. מלבד החלטה תיאורי גרידא של הדפוס ביטוי mRNA או חלבון של רצפטורים אינטגרינים ו כימוקין על לימפוציטים היקפיים או ריאות הסתננות ומדידה משלימים המתאימים כימוקין רמות בדם. bronchoalveolar שטיפה (BAL) או רקמת הריאה12,13,14,15, מבחני תרבות תא במבחנה ומבוססת לאפשר אפיון פונקציונלי של לימפוציטים אדהזיה או כימוטקסיס על הגדרת תנאים ניסיוני16,17,18. בעקרון, מבחני אדהזיה במבחנה סטטי לפקח הקיבולת איגוד של לימפוציטים בתרבית של טפט אנדותל או שקופיות זכוכית מצופה מולקולות אדהזיה אנדותל רקומביננטי (כגון MAdCAM 1, VCAM-1), תוך גופית רגילה מבחני כימוטקסיס חלים בדרך כלל על מנת לכמת את היכולת של לימפוציטים להעביר לאורך הדרגתי כימוקין מערכת transwell19. שתי ההגדרות במבחנה לאפשר התאמה מבוקרת עם אפנון של תנאי הניסוי, אך מאידך חסר משתנים חשובים ידוע באופן ביקורתי את ההשפעה על כימוטקסיס ויוו והצמדות של לימפוציטים. בעיקר, מבחני תרבות תא סטטי להתעלם השפעת כוחות הטיה הנגרמת על ידי זרימת דם קבוע19 , פוטנציאל להזניח את המעורבות של חצרו אימונולוגי שמסביב תאים חיסוניים אינטראקציה אי-לימפוציטים, שניהם מציגים אורגניזם חי. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הפרשנות של התוצאות שהושגו סטטי במבחנה מבחני כימוטקסיס או הדבקות צריך עוד יותר אימות בניסויים אדהזיה דינמי תחת זרימה תנאים20,21 וב ב מודלים vivo של פתולוגיה דלקתית איברים19. אכן, חשוב יכול ניתן להסיק מסקנות על התקנון של תא T ריאות ביות בתנאים דלקתית או אלרגי מחקרים בבעלי חיים ניתוח גנטית שונה עכברים מודלים מוגדרים של מחלות שונות3, 22 , 23. ההשוואה הכמותית הריאה שחדר לימפוציטים בין wildtype עכברים ועכברים עם מחסור עבור גנים ספציפיים עניין מייצג כלי ומבוססת ומשמש באופן נרחב עבור הגדרת את ההשפעה של סלולרי מסוים מסלולים או רצפטורים על התבנית מונחה-מחלה של התפלגות T cell. עם זאת, בניגוד ל לפני דנו תא במבחנה מבחני תרבות, עיצוב המחקר מבוסס על מודלים קלאסיים חסרה את היכולת לנתח ולנטר העיקרי בתאי T האדם נגזרת ישירות בדם או BAL של חולים הסובלים ריאה דלקתיות המחלה. לכן, זה עדיין נשאר מאתגר לאמת באופן פונקציונלי אם מחלת ריאות אבחונית שצוין הוא מסוגל להטביע לימפוציטים אנושיים tropism ריאות מועדף, עד כמה פרמטרים קליניים העלולים להשפיע על התרחיש הזה. לאחרונה, בגישה ויוו אלגנטי מאוד הוצג בהקשר של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), אשר היה מסוגל להתגבר על רוב מגבלות אלה ופתח אפיקים חדשה השתלמות translational על לימפוציטים מעיים ביות24 . תוך ניצול פרוטוקולים עבור ניקוי רקמות ממס מבוסס ואחריו קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות חתך הרוחב מיקרוסקופ הדמיה ככלי רב עוצמה, זה היה אפשר לדמיין את חדירה והפצה של תאי T אדם הועבר adoptively במעי של עכברים immunodeficient colitic24. בפרט, הגדרה ניסויית זו מיושמת שני חידושים עיקריים: (1) ראשי תאים חיסוניים האנושי ניתן לנתח בתנאים ויוו השפעול מוגדרים; (2) שטח די גדול של האיבר הפגוע (כ 1.5 ס מ x 1.5 ס מ) יכול לדימות באיכות ברזולוציה גבוהה, ואחריו 3D-שיקום. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מספר בהצלחה הקים השימוש ממס מבוסס רקמות ניקוי מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות ככלים חשובים ריאה מתקדם הדמיה25,26. על מנת להפיק תועלת זו התקדמות טכנולוגית בתחום אימונולוגיה ריאתי, אנחנו עכשיו אימצו את השיטה לניתוח של יונת ריאות.
פרוטוקול שהוצגו כאן מספק הקדמה צעד אחר צעד איך לטהר ותווית fluorescently T אנושיים ראשי תאים עבור העברת לתוך עכברים עם דלקת ריאות המושרה, יתר על כן, מתאר בפירוט את התהליך עוקבות של אור גיליונות קרינה פלואורסצנטית הדמיה מיקרוסקופיים, כולל עוגב הכנה ועיבוד תמונה. בסך הכל, אנו מקווים לתמוך מחקרים translational עתידיים בתחום מחלות ריאה דלקתיות או אלרגי על ידי החדרת שילוב מתוחכם, אבל בכל זאת ריאלי, ניסיוני דגם לניטור לימפוציטים אנושיים יונת ריאות על התנאים ויוו.
ההגדרה ניסיוני שתואר כאן מספק ההזדמנות כדי לפקח על ביות ריאות של תאים חיסוניים האנושי הראשי תחת התנאים דלקתית ויוו, ובכך relevantly משלים בסגנון קלאסי הופיעה אדהזיה במבחנה כימוטקסיס מבחני. כדי לקחת בחשבון מאפיינים איבר אנטומי ספציפי של הריאה, היבטים חשובים של תאים חיסוניים ביו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים להכיר בהכרת תודה מימון על ידי 1181 SFB של מרכזי מחקר DFG שיתופי trr ב 241. אופטי הדמיה מרכז ארלאנגן (OICE) ואת מסוים ראלף Palmisano, פיליפ Tripal, טינה Fraaß (פרוייקט Z2 של 1181 CRC DFG) הם הכירו עבור מומחה תמיכה טכנית עבור הדמיה מיקרוסקופי אור גיליונות זריחה.
Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |