De linker Pneumectomie in combinatie met Monocrotaline of Sugen als een Model van pulmonale hypertensie bij ratten
Summary
De knaagdieren links Pneumectomie is een waardevolle techniek in pulmonale hypertensie onderzoek. Hier presenteren we een protocol om te beschrijven de rat Pneumectomie procedure en postoperatieve zorg aan minimale morbiditeit en mortaliteit.
Abstract
In dit protocol, detailleren wij de juiste procedurele stappen en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen om met succes uitvoeren van een linker Pneumectomie en PAH induceren bij ratten met de extra toediening van monocrotaline (MCT) of SU5416 (Sugen). Ook vergelijken we deze twee modellen tot andere PAH-modellen vaak in onderzoek worden gebruikt. In de afgelopen jaren, is de focus van PAH diermodellen verhuisd naar het bestuderen van het mechanisme van de angioproliferation van Meervormige laesies, waarin de rol van pulmonaire verhoogde bloedtoevoer wordt beschouwd als een belangrijke trigger in de ontwikkeling van ernstige pulmonale vasculaire remodeling. Een van de meest veelbelovende knaagdier modellen van verhoogde pulmonaire flow is de eenzijdige linker Pneumectomie gecombineerd met een ‘tweede hit’ van MCT of Sugen. De verwijdering van de linker long leidt tot verhoogde en turbulente pulmonaire doorbloeding en vasculaire remodeling. Op dit moment is er geen gedetailleerde procedure voor de chirurgie van de Pneumectomie bij ratten. Dit artikel geeft een stapsgewijze protocol van de Pneumectomie chirurgische ingreep en post-operatieve zorg bij mannelijke Sprague-Dawley ratten. Kortom, het dier wordt verdoofd en de borst wordt geopend. Zodra de linker longslagader longader en de bronchiën worden gevisualiseerd, ze als ligatuur zijn verbonden en de linker long wordt verwijderd. De borst is dan gesloten en het dier teruggevorderd. Bloed is gedwongen om te circuleren alleen op de juiste Long. Deze toegenomen vasculaire druk leidt tot een progressieve remodelleren en occlusie van kleine pulmonary slagaders. De tweede honkslag van MCT of Sugen is gebruikte een week na operatie voor het opwekken van endotheel disfunctie. De combinatie van verhoogde bloedstroom in de longen en endotheel disfunctie produceert ernstige PAH. De belangrijkste beperking van deze procedure is dat het algemene chirurgische vaardigheden vereist.
Introduction
Pulmonale arteriële hypertensie (PAH) is een progressieve en dodelijke ziekte die wordt gekenmerkt door een toename van de pulmonaire bloedstroom, toegenomen vasculaire weerstand, ontsteking en verbouwing van kleine pulmonaire bloedvaten1. Deze remodelleren meestal resulteert in vasculaire laesies die te belemmeren en vernietigen van kleine pulmonary slagaders, waardoor de vasoconstrictie en toenemende rechterventrikel afterload2. Enkele succesvolle farmacologische behandelingen van PAH bestaan; Als gevolg, PAH-gerelateerde sterfte blijft hoog. Onlangs, de focus van het onderzoek naar de pathobiology van pulmonale hypertensie is verhuisd naar een mechanisme van angio-proliferatie waarin de rol van pulmonaire verhoogde bloedtoevoer wordt beschouwd als een belangrijke trigger in de ontwikkeling van de pulmonaire vasculaire het remodelleren van3,4.
Dierlijke modellen van pulmonale hypertensie hebben verstrekt kritische inzichten die helpen verklaren de pathofysiologie van de ziekte te hebben gediend als een platform voor drug-, cel-, gen- en eiwit levering. De chronische hypoxie-geïnduceerde pulmonale hypertensie en de MCT long letsel model hebben van oudsher de belangrijkste modellen gebruikt bij het bestuderen van PAH pathofysiologie5. Nochtans, zijn zij niet volstaat om verhoogde pulmonaire bloed stroom en neointimal patroon aan het remodelleren van in vergelijking tot wijzigingen beschreven in menselijke patiënten. Het model van chronische hypoxie in knaagdieren resulteert in verdikking van wanden met hypoxische vasoconstrictie zonder angio-vernietiging van kleine pulmonaire vaartuigen6. Bovendien is de toestand van hypoxie omkeerbaar. Het model van hypoxie is dus ook niet volstaat om ernstige PAH. De MCT long letsel model sommige endotheel disfunctie uitlokken maar de complexe vasculaire obliterative laesies gevonden bij mensen met ernstige primaire PAH niet ontwikkelen in de ratten2. Bovendien hebben MCT-behandelde ratten de neiging om te sterven uit Long MCT-geïnduceerde toxiciteit, veno-occlusieve leverziekte en myocarditis, in plaats van PAH2. Tenslotte is de Pneumectomie alleen niet voldoende voor de productie van neointimal laesies in de kleine pulmonaire bakken in een korte periode van tijd. Na de Pneumectomie is er minimale hoogte in pulmonaire arteriële druk7. Bij de mens, is de Pneumectomie wanneer de contralaterale Long gezonde7 isgoed verdragen.
De procedure van de linker Pneumectomie gecombineerd met MCT of Sugen is echter gunstig omdat het pulmonaire verhoogde bloedtoevoer nabootst en in de pulmonaire vasculaire remodeling vergelijkbaar met ernstige klinische PAH resulteert. De Pneumectomie wordt uitgevoerd op de linker long, die heeft slechts 1 kwab, in plaats van aan de rechterkant, die heeft vier kwabben. Als de juiste Long werd verwijderd, is het dier zou niet in staat om te compenseren voor de respiratoire insufficiëntie. In het Pneumectomie-MCT-model ontwikkelt neointimal patroon van het remodelleren in meer dan 90% van geëxploiteerd-behandelde dieren7. Ook de combinatie van Sugen en Pneumectomie resulteert in ernstige PAH, gekenmerkt door angio-obliterative vasculaire laesies, proliferatie, apoptosis en RV dysfunctie8. De linker Pneumectomie-procedure is ook voordelig in vergelijking met andere chirurgische procedures voor het opwekken van PAH. Eerder omvatten beschreven modellen bij ratten te verhogen van pulmonaire bloedtoevoer naar de longen de aorto-caval shunt of subclavian-pulmonaire slagader anastomose. Deze modellen zijn zeer ingewikkeld7,9,10,11. Voor het uitvoeren van een aorto-caval shunt, moet de buik van het dier worden geopend. De shunt wordt geplaatst in de abdominale aorta, waardoor de bloedtoevoer naar alle buikorganen in plaats van alleen de longen, dus pak duurt veel langer om te ontwikkelen. Bovendien is het moeilijk om te bepalen van de bloedstroom door de shunt, overwegende dat met de Pneumectomie het bloed stroom naar het resterende Long dubbelspel. De subclavian-pulmonaire slagader wapendrager heeft ook veel complicaties. De stroom van arteriële bloed in de ader kan leiden tot trombose van anastomose en bloeden. Zoals de aorto-caval shunt is het moeilijk om te bepalen van de bloedstroom door de anastomose. Bovendien, het is een dure en moeilijk techniek waarvoor vasculaire chirurgische vaardigheden. De unilaterale linker Pneumectomie verdubbelt bloedstroom en shear stress in de contralaterale Long en, in combinatie met MCT of Sugen, veroorzaakt de typische hemodynamische en histopathologische bevindingen van PAH oftewel endothelial cel schade8, 12.
De nieuwheid van dit manuscript wordt gepresenteerd in het zeer gedetailleerde en uitgebreide chirurgische protocol van de linker Pneumectomie bij ratten en bij de bespreking van de technische en fysiologische uitdagingen van deze modellen. Omdat dit protocol momenteel niet beschikbaar is, veel onderzoekers geloven dat het model is te moeilijk gebruik. Onderzoekers die tot het verrichten van de linker Pneumectomie geconfronteerd met hoge sterfte en morbiditeit tarieven die zijn gekoppeld aan het geen onnodige verlies van dieren, afbreuk te doen aan de wetenschappelijke beoordeling. In plaats daarvan zal veel klassieke modellen zoals MCT injectie, chronische hypoxie, of gewoon de Pneumectomie gebruiken om te maken van PAH. Deze modellen zijn echter veel minder effectief dan de combinatie van MCT of Sugen met de linker Pneumectomie. Het primaire doel van dit artikel is het eerste gedetailleerde en reproduceerbare chirurgische protocol voorzien de linker eenzijdige Pneumectomie bij ratten en bieden de beste chirurgische model van PAH. Dit protocol voor linker eenzijdige Pneumectomie te combineren met MCT of SU5416 kunnen onderzoekers om een veel effectiever en klinisch relevante model van ernstige pak te bestuderen van de pathogenese van deze fatale ziekte te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In pak geteisterde longen, vasculaire proliferatie met neointimal formatie en de vernietiging van de pulmonary slagaders leiden tot ernstige hemodynamische veranderingen, rechts-ventriculaire storingen en vroegtijdige sterfte7,8. De wijzigingen in de wanden vergroten resistentie tegen doorbloeding, toenemende druk van arteriële en rechts ventriculaire In de vroege stadia van PAH ontwikkelde meestal 3 weken na het beheren van MCT of Sugen, ratten niet-specifieke …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript werd gesteund door de NIH verlenen 7R01 HL083078-10 verleent van de American Heart Association AHA-17SDG33370112 en uit de nationale instituten van gezondheid NIH K01 HL135474 tot aan en van de nationale instituten van gezondheid R01 HL133554 aan L.H.
Materials
| Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | Incision |
| Forane (Isoflurane, USP) | Baxter | NDC 10019-360-40 | anesthesia |
| BD Angiocath 16 G | BD | 381157 | intubation tube, chest tube |
| BD 1 mL Insulin Syringe | BD | 329652 | administer buprinex post-operatively |
| Biogel Surgeons Surgical Gloves | Biogel | 30460-01 | sterile surgical gloves |
| Wahl BravMini+ Trimmer | Braintree Scientific | CLP-41590 P | shave surgical site |
| SU5416 | Cayman Chemical | 13342 | Sugen |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | EW-41723-02 | light for intubation |
| Surgipro II 4-0 Suture | Covidien | VP831X | Closing intercostal muscles |
| Polysorb 5-0 Suture | Covidien | GL-885 | Closing skin |
| Medium Slide Top Induction Chamber | DRE Veterinary | 12570 | oxygen & isoflurane delivery |
| DRE Compact 150 Rodent Anesthesia Machine | DRE Veterinary | 373 | oxygen & isoflurane delivery |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | cauterizer to minimize bleeding |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | ventilator |
| MouseSTAT Jr | Kent Scientific | MSTAT-JR | pulse oximeter & heart rate monitor |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific | SPO2-MSE | pulse oximeter & heart rate paw sensor |
| PhysioSuite RightTemp | Kent Scientific | PS-02 | temperature pad |
| PVP Prep Solution | Medline | MDS093944 | Cleaning surgical site |
| Poly-lined Drape | Medline | NON21002Z | cover animal |
| 3 mL syringe | Medline | SYR103010 | administer fluids post-operatively |
| Microsurgical Kits, Integra | Miltex | 95042-540 | surgical tools: plain wire speculum, double-ended probe, McPherson-Vannas Iris scissors straight, straight iris scissors |
| Hemostatic forceps – Micro-Jacobson-Mosquito | Miltex | 17-2602 | mosquito |
| Buprenorphrine HCl 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-01 | Pain relief |
| Cooley-Mayo curved scissors | Pilling | 352090 | Large scissors |
| Gerald Tissue forceps | Pilling | 351900 | forceps |
| Wangesnsteen Tissue Forceps | Pilling | 342929 | atraumatic forceps |
| Pilling Thin Vascular Needle Holder | Pilling | 354962DG | needle holder |
| Crotaline | Sigma-Aldrich | C2401-1G | MCT |
| Surflash 20 G IV Catheter | Terumo | SR*FF2051 | For pressure reading during organ harvest |
| ADVantage PV System with 1.2 Fr Catheter | Transonic Inc | ADV500 | Record pulmonary artery and right ventricle pressure |
| Medium Hemoclip | Weck | 523700 | ligate vessels |
| Open Ligating Clip Applicator; Medium, curved | Weck Horizon | 237081 | hemoclip applicator |
| Surgical Microscope | Zeiss OPMI MD | 1808 | magnification |
References
- Leopold, J., Maron, B. Molecular Mechanisms of Pulmonary Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 761 (2016).
- Gomez-Arroyo, J. G., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L363-L369 (2012).
- van Albada, M. E., et al. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. European Respiratory Journal. 26 (3), 487-493 (2005).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A. J., Berger, R. M. F. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: lessons from preclinical animal models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (6), L1013-L1032 (2009).
- Cahill, E., et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally. Experimental Physiology. 97 (6), 796-806 (2012).
- Okada, K., et al. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. American Journal of Pathology. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- Happé, C. M., et al. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Tanaka, Y., Schuster, D. P., Davis, E. C., Patterson, G. A., Botney, M. D. The role of vascular injury and hemodynamics in rat pulmonary artery remodeling. Journal of Clinical Investigation. 98 (2), 434-442 (1996).
- Nishimura, T., Faul, J. L., Berry, G. J., Kao, P. N., Pearl, R. G. Effect of a surgical aortocaval fistula on monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Critical Care Medicine. 31 (4), 1213-1218 (2003).
- Linardi, D., et al. Ventricular and pulmonary vascular remodeling induced by pulmonary overflow in a chronic model of pretricuspid shunt. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (6), 2609-2617 (2014).
- White, R. J., et al. Plexiform-like lesions and increased tissue factor expression in a rat model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L583-L590 (2007).
- Samson, N., Paulin, R. Epigenetics, inflammation and metabolism in right heart failure associated with pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (3), 572-587 (2017).
