प्राथमिक संस्कृतिक माउस में ऑक्सीजन की खपत दर का विश्लेषण एक Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर नवजात Cardiomyocytes
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कैसे विभिंन कारकों दिल में ऑक्सीजन की खपत को बदल सकते है की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करने के लिए वर्णन है ।
Abstract
Mitochondria और ऑक्सीडेटिव चयापचय हृदय की मांसपेशी समारोह को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं । अनुसंधान से पता चला है कि mitochondrial शिथिलता हृदय विफलता में पाया बिगड़ा हृदय समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान कारक है । इसके विपरीत, दोषपूर्ण mitochondrial समारोह बहाल लाभकारी प्रभाव हो सकता है दिल में असफल हृदय समारोह में सुधार होगा । इसलिए, विनियामक तंत्र का अध्ययन और mitochondrial समारोह के लिए उपंयास नियामकों की पहचान अंतर्दृष्टि जो हृदय रोग के इलाज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को विकसित किया जा सकता है प्रदान कर सकता है । यहां, कार्डिएक myocyte mitochondrial श्वसन एक अद्वितीय कोशिका संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर विश्लेषण किया है । सबसे पहले, एक प्रोटोकॉल को तेजी से अलग और संस्कृति उच्च व्यवहार्यता नवजात माउस cardiomyocytes को अनुकूलित किया गया है । फिर, एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक इन cardiomyocytes की ऑक्सीजन की खपत दर का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम बोने की स्थिति को अनुकूलित और दिखा दिया है कि नवजात माउस cardiomyocytes ऑक्सीजन की खपत दर आसानी से एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक में मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, हम ध्यान दें कि हमारे प्रोटोकॉल एक बड़ा संस्कृति आकार और अंय अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है, ऐसे intracellular संकेतन और सिकुड़ा समारोह विश्लेषण के रूप में ।
Introduction
एक सतत कार्डियक सिकुड़ा समारोह को बनाए रखने के लिए, cardiomyocytes को मुख्य रूप से एटीपी1के रूप में सेलुलर ऊर्जा की एक निरंतर आपूर्ति बनाए रखना चाहिए । दिल में, एटीपी के लगभग ९५% mitochondria द्वारा उत्पंन होता है, मुख्य रूप से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से, दिखा रहा है कि mitochondria कार्डियक फंक्शन2,3में एक महत्वपूर्ण ऊर्जावान भूमिका निभाते हैं । इस धारणा का समर्थन है कि mitochondrial समारोह के dysregulation cardiomyopathy और दिल की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते है4,5। इसके विपरीत, mitochondrial समारोह बहाल करने के लिए असफल दिल6,7के कार्डियक समारोह में सुधार दिखाया गया है । इसलिए, mitochondrial के तंत्र का अध्ययन और cardiomyocytes में mitochondrial समारोह के उपंयास नियामकों की पहचान न केवल हृदय ऊर्जा उत्पादन के यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रकट होगा, लेकिन यह भी अंतर्दृष्टि है कि नेतृत्व करेंगे प्रदान कर सकता है हृदय रोगों के उपचार के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों के विकास के लिए6,8.
पूरे दिल की तुलना में, जो myocytes और गैर myocytes9का एक मिश्रण होता है, cardiomyocyte संस्कृतियों अत्यंत शुद्ध कर रहे हैं, गैर के ंयूनतम संदूषण के साथ दिल से myocytes, जैसे fibroblasts और endothelial10कोशिकाओं । इसके अलावा, नवजात पिल्ले से अलग cardiomyocytes, वयस्क दिल10,11से अलग कोशिकाओं की तुलना में समय की एक छोटी राशि में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या संवर्धन सक्षम बनाता है । सबसे महत्वपूर्ण, प्राथमिक संस्कृति वयस्क माउस cardiomyocytes लघु अस्तित्व समय है (जैसे 24 घंटे) और लंबे समय अंक de-अंतर पर । नवजात माउस cardiomyocytes जीवित है और संस्कृति में 7 दिनों के ऊपर के लिए हेरफेर किया जा सकता है, उंहें दवा यौगिकों और mitochondria के cardiomyocytes10में समारोह पर जीन हेरफेर के प्रभाव के परीक्षण के लिए आदर्श बना । बेशक, वहां वयस्क और नवजात कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण जैविक मतभेद हैं, लेकिन अब नवजात कोशिकाओं की संस्कृति के लिए उपलब्ध अवधि उंहें अध्ययन के कई विभिंन प्रकार के लिए उपयुक्त बनाता है, mitochondrial समारोह के उन सहित ।
तारीख करने के लिए, प्राथमिक कल्चरल नवजात माउस और चूहे cardiomyocytes हृदय में12,13अध्ययन करने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हाल के वर्षों में, अध्ययन एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक के लिए ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) को मापने और माउस और चूहे नवजात cardiomyocytes14,15में ऑक्सीडेटिव क्षमता का मूल्यांकन करते थे । जबकि चूहों की तुलना में, माउस नवजात cardiomyocytes की कोशिका व्यवहार्यता कम है और अधिक परिवर्तनशीलता16है । इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडलों से कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता माउस सेल मॉडल बहुत महत्वपूर्ण बनाता है । यह देखते हुए कि ओसीआर अध्ययन सेल संख्या और बोने की सघनता, एक reproducible के विकास के प्रति संवेदनशील हैं, विश्वसनीय, और सरल प्रोटोकॉल अनुरूप कोशिका उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
यहां, हम रिपोर्ट एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि विकसित किया गया है जो एक ९६-अच्छी तरह से ओसीआर विश्लेषण के लिए प्रारूप extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ साथ संस्कृतिक माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करता है । इस प्रोटोकॉल बहुत परख के reproducibility बढ़ जाती है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल न केवल एक उपंयास और ओसीआर विश्लेषण के लिए reproducible विधि प्रदान करता है, लेकिन यह भी अंय प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए एक बड़ा आकार संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि जो myofibrillar कार्यों और intracellular अध्ययन की जरूरत हो सकती है संकेत रास्ते ।
विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल एक ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में अलगाव और नवजात माउस cardiomyocytes की संस्कृति के लिए एक दिन की प्रक्रिया का वर्णन । इसके अलावा, यह एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए प्रक्रिया का वर्णन । उपयोग किए गए सभी समाधान बाँझ या बाँझ फ़िल्टर कर रहे हैं. सभी उपकरण ७५% इथेनॉल द्वारा निष्फल रहे हैं । हम प्रक्रिया के विभिंन भागों के लिए सामग्री की एक मेज प्रदान करते हैं । संवर्धन cardiomyocytes के लिए, सभी प्रक्रियाओं और कदम एक मानक सेल संस्कृति हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल एक कूड़े से नवजात माउस दिल के अलगाव के लिए विकसित की है (लगभग 8-10 पिल्ले) । हालांकि, प्रोटोकॉल भी कई कूड़े से cardiomyocytes अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम अलग और संवर्धन माउस नवजात cardiomyocytes के लिए एक सरल प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इन cardiomyocytes का उपयोग करके, हम भी एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक प्रणाली का उपयोग करके ऑक्सीजन की खपत दर को मापने के लिए शर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सभी रॉस लैब और मर्फी लैब के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (14SDG17790005) द्वारा Y.C. NIH (HL115933, HL127806) और VA मेरिट (BX003260) को R.S.R. करने के लिए समर्थित है
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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