Analysere ilt forbrugssats i primære kulturperler mus Neonatal Cardiomyocytes ved hjælp af en ekstracellulære Flux Analyzer
Summary
Målet med denne protokol er at illustrere, hvordan du bruger musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i hjertet.
Abstract
Mitokondrier og oxidative metabolisme er afgørende for at opretholde hjerte muskelfunktion. Forskning har vist, at mitokondriel dysfunktion er en vigtig medvirkende faktor til nedsat hjertefunktion fundet i hjertesvigt. Derimod kan genoprette defekte mitokondrie funktion have gavnlige effekter til at forbedre hjertefunktion i svigtende hjerte. Derfor, at studere de reguleringsmekanismer og identificere roman regulatorer til mitokondrie funktion kunne give indsigt, som kunne bruges til at udvikle nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme. Her, er hjerte myocyte mitokondrie respiration analyseret ved hjælp af en unik celle kultur system. Først, en protokol er optimeret, så hurtigt isolere og kultur høj rentabilitet neonatal mus cardiomyocytes. Derefter, en 96-brønds format ekstracellulære flux analyzer bruges til at vurdere ilt forbrug på disse cardiomyocytes. For denne protokol, vi optimeret såning betingelser og demonstreret at neonatal mus cardiomyocytes ilt forbrugssats kan vurderes let i en ekstracellulære flux analyzer. Endelig, vi konstatere, at vores protokol kan anvendes til en større størrelse, kultur og andre undersøgelser, såsom intracellulær signalering og kontraktile fungere analyse.
Introduction
For at opretholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunktion, skal cardiomyocytes opretholde et konstant tilførsel af cellulære energi primært i form af ATP1. I hjertet, er ca. 95% af ATP genereret af mitokondrier, hovedsagelig gennem oxidativ fosforylering, viser, at mitokondrier spiller en afgørende bioenergetic rolle i hjertefunktion2,3. Støtte til dette begreb er der dysregulering af mitokondrie-funktionen kan føre til kardiomyopati og hjertesvigt4,5. Omvendt, genoprette mitokondrie funktion har vist at forbedre hjertefunktion af svigtende hjerte6,7. Derfor, at studere mekanismen af mitokondrie bioenergetik og identificere roman regulatorer af mitokondrie-funktionen i cardiomyocytes vil ikke kun afsløre mekanistiske indblik i hjertets energiproduktion men også kunne give indsigt, der vil føre til udvikling af nye terapeutiske mål for behandling af hjertesygdomme6,8.
I forhold til hele hjertet, som indeholder en blanding af myocytes og ikke-myocytes9, cardiomyocyte kulturer er meget ren, med minimal forurening af ikke-myocytes fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. Desuden isolerer cardiomyocytes fra neonatal pups muliggør dyrkning af et stort antal celler i en lille mængde af tid, sammenlignet med isolerende celler fra voksne hjerter10,11. Vigtigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse tid (f.eks. 24 h) og på længere tid punkter at differentiere. Neonatal mus cardiomyocytes kan overleve og manipuleres til op til 7 dage i kultur, hvilket gør dem ideelle til afprøvning af virkningerne af narkotika forbindelser og genmanipulation på funktionen af mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, der er væsentlige biologiske forskelle mellem de voksne og neonatal celler, men den længere varighed for kultur af neonatal celler gør dem velegnet til mange forskellige typer af undersøgelser, herunder de af mitokondrie funktion.
Til dato, har primære kulturperler neonatal mus og rotter cardiomyocytes været brugt som modeller til at undersøge hjertets bioenergetik12,13. I de seneste år brugt undersøgelser en ekstracellulære flux analyzer til at måle ilt forbrugssats (OCR) og evaluere oxidative kapacitet i mus og rotter neonatal cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, mus neonatal cardiomyocytes celle levedygtighed er lavere og har større variabilitet16. Også gør mulighed for at studere celler fra genetisk modificerede musemodeller musen celle model meget vigtigt. OCR undersøgelser er så følsomme over for celle nummer og såning tæthed, er udvikling af en reproducerbar, pålidelig og enkel protokol til at opnå ensartede celle udbytte og levedygtighed nødvendig.
Her rapporterer vi en optimeret protokol, der er blevet udviklet som bruger kulturperler mus neonatal cardiomyocytes sammen med en 96-brønd-format ekstracellulære flux analyzer for OCR analyse. Denne protokol øger reproducerbarhed af analysen. Derudover protokollen ikke kun giver en roman og reproducerbar metode til OCR analyse, men også kunne blive tilpasset til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, som den, der kan være behov for at undersøge myofibrillar funktioner og intracellulære signalering veje.
Især beskriver denne protokol en endags-procedure for isolation og kultur af neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønd celle kultur plade. Derudover beskriver det procedure for at måle iltforbrug ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer. Alle løsninger bruges er sterile eller sterile filtreret. Alle værktøjer er steriliseret ved 75% ethanol. Vi leverer en Tabel af materialer til forskellige dele af proceduren. Til dyrkning af cardiomyocytes, udføres alle procedurer og trin i en standard celle kultur hætte. Denne protokol er udviklet til isolering af neonatal mus hjerter fra et kuld (ca 8-10 unger). Protokollen kan dog også være tilpasset til at isolere cardiomyocytes fra flere kuld.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse, har vi etableret en enkel protokol til isolering og dyrkning mus neonatal cardiomyocytes. Ved hjælp af disse cardiomyocytes, optimeret vi også betingelser at måle ilt forbrugshastigheden ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gør det muligt at bruge musen neonatal cardiomyocytes som et modelsystem til at undersøge, hvordan forskellige faktorer kan ændre iltforbrug i de vigtigste arbejde celler i hjertet, beslægtet med hvad vil blive målt i intakt organ. Vores pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbejde støttes af American Heart Association (14SDG17790005) til YC NIH (HL115933, HL127806) og VA Merit (BX003260) til R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
