Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer
Summary
Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.
Abstract
Mitochondriën en oxidatieve metabolisme zijn kritisch voor de handhaving van de functie van de hartspier. Onderzoek heeft aangetoond dat mitochondriale dysfunctie is een belangrijke factor die bijdraagt aan verminderde hartfunctie bij hartfalen gevonden. Daarentegen, kan herstel van defecte mitochondriale functie hebben gunstige effecten ter verbetering van de hartfunctie in het falende hart. Dus, de regulerende mechanismen te bestuderen en het identificeren van nieuwe regelgevende instanties voor mitochondriale functie kunnen inzicht geven die kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten. Hier, wordt cardiale myocyte mitochondriale ademhaling geanalyseerd met behulp van een unieke celcultuur. Ten eerste, een protocol is geoptimaliseerd om snel isoleren en hoge levensvatbaarheid neonatale muis cardiomyocytes cultuur. Vervolgens wordt een 96-Wells-indeling extracellulaire flux analyzer gebruikt ter beoordeling van de zuurstof verbruik tarief van deze cardiomyocytes. Voor dit protocol, we geoptimaliseerd zaaien voorwaarden en aangetoond dat pasgeborenen muis cardiomyocytes zuurstof verbruik tarief kan gemakkelijk worden beoordeeld in een extracellulaire flux-analysator. Tot slot, wij stellen vast dat ons protocol kan worden toegepast op een groter formaat van de cultuur en andere studies, zoals de intracellulaire signalering en contractiele functie analyse.
Introduction
Om een continue contractiele hartfunctie, moeten cardiomyocytes behouden een constante aanvoer van cellulaire energie voornamelijk in de vorm van ATP1. In het hart, wordt ongeveer 95% van ATP gegenereerd door mitochondriën, voornamelijk door middel van oxidatieve fosforylatie, waaruit blijkt dat de mitochondria een sleutelrol in de bio-energetische in hartfunctie2,3 spelen. Het ondersteunen van dit begrip is dat disregulatie van mitochondriale functie kan leiden tot cardiomyopathie en hartfalen4,5. Omgekeerd, herstel van mitochondriale functie is aangetoond dat verbetering van de hartfunctie van het falende hart6,7. Daarom, bestuderen van het mechanisme van de mitochondriale Bioenergetica en het identificeren van nieuwe toezichthouders van mitochondriale functie in cardiomyocytes mechanistische inzichten van cardiale energieproductie alleen niet zal onthullen maar ook kunnen inzicht geven die zal leiden aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelen voor de behandeling van hart-en vaatziekten6,8.
Vergeleken met het hele hart, waarin een mengsel van myocytes en niet-myocytes9, cardiomyocyte culturen zijn uiterst zuiver, met minimale besmetting van niet-myocytes vanuit het hart, zoals fibroblasten en endotheliale cellen10. Bovendien, isoleren van cardiomyocytes van neonatale pups kan kweken een groot aantal cellen in een kleine hoeveelheid tijd, in vergelijking met isolerende cellen van volwassen harten10,11. Bovenal primaire gekweekte volwassen muis cardiomyocytes hebben korte overleving tijden (bijv. 24 uur) en bij langere tijd punten-onderscheid maken. Neonatale muis cardiomyocytes kunnen overleven en voor meer dan 7 dagen in de cultuur, waardoor ze ideaal zijn voor het testen van de effecten van de drug compounds en genetische manipulatie op de functie van mitochondriën in cardiomyocytes10worden gemanipuleerd. Natuurlijk, er zijn aanzienlijke biologische verschillen tussen de volwassen en neonatale cellen, maar de langere duur die beschikbaar zijn voor cultuur van neonatale cellen maakt ze geschikt voor vele verschillende types van studies, met inbegrip van die van mitochondriale functie.
Tot op heden, zijn primaire gekweekte neonatale muis en rat cardiomyocytes gebruikt als modellen om te studeren cardiale Bioenergetica12,13. In de afgelopen jaren gebruikt studies een extracellulaire flux analyzer meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) en evalueren van oxidatieve capaciteit in muis en rat neonatale cardiomyocytes14,15. Terwijl in vergelijking met ratten, de levensvatbaarheid van de cellen van de neonatale cardiomyocytes muis is lager en heeft grotere variabiliteit16. De mogelijkheid te bestuderen van cellen uit genetisch gemodificeerde Muismodellen maakt de mobiele muismodel ook, heel belangrijk. Gezien het feit dat OCR studies zo gevoelig zijn voor cel nummer en dichtheid te zaaien, is de ontwikkeling van een protocol reproduceerbaar, betrouwbare en eenvoudig te bereiken consistente cel opbrengst en levensvatbaarheid nodig.
Wij rapporteren hier een geoptimaliseerde protocol dat is ontwikkeld die gebruik maakt van de neonatale cardiomyocytes gekweekte muis samen met een 96-goed-formaat extracellulaire flux analyzer voor OCR analyse. Dit protocol verhoogt de reproduceerbaarheid van de test. Bovendien, het protocol biedt niet alleen een roman en reproduceerbare methode voor de analyse van de OCR, maar ook tot een grotere grootte cultuur zou kunnen worden aangepast voor andere experimentele doeleinden, zoals die die wellicht nodig zijn om te studeren van myofibrillar functies en intracellulaire Signaalroutes.
Met name beschrijft dit protocol een eendaagse procedure voor isolatie en cultuur van neonatale muis cardiomyocytes in een 96-Wells cel cultuur plaat. Bovendien, het wordt de procedure beschreven voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van een extracellulaire flux-analyzer. Alle oplossingen gebruikt worden steriel of steriele gefilterd. Alle tools zijn gesteriliseerd door 75% ethanol. Wij bieden een Tabel van materialen voor diverse onderdelen van de procedure. Voor het kweken van cardiomyocytes, worden alle procedures en stappen uitgevoerd in een standaard cel cultuur kap. Dit protocol is ontwikkeld voor de isolatie van neonatale muis harten uit één nest (ongeveer 8-10 pups). Het protocol kan echter ook worden aangepast voor het isoleren van cardiomyocytes uit meerdere nesten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een eenvoudig protocol om te isoleren en kweken van muis neonatale cardiomyocytes opgericht. Met behulp van deze cardiomyocytes, we ook de voorwaarden voor het meten van zuurstof verbruik tarief met behulp van een systeem van extracellulaire flux analyzer geoptimaliseerd. Het protocol maakt het mogelijk om het gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe verschillende factoren zuurstofverbruik in de belangrijkste werkende cellen van het hart, verwant aan wa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken alle Ross lab en Murphy lab leden. Dit werk wordt ondersteund door de American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) en VA verdienste (BX003260) aan R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
