Analysere oksygen forbruksraten i primære kulturperler musen neonatale Cardiomyocytes bruker en ekstracellulære Flux analyserer
Summary
Målet med denne protokollen er å illustrere hvordan du bruker musen neonatale cardiomyocytes som modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i hjertet.
Abstract
Mitokondrier og oksidativt metabolisme er avgjørende for å opprettholde Hjertemuskel funksjon. Forskning har vist at mitokondrie dysfunksjon er en viktig medvirkende faktor til svekket cardiac funksjon i hjertesvikt. Derimot kan gjenopprette defekt mitokondrie funksjonen ha gunstige effekter å forbedre hjertefunksjon i sviktende hjertet. Derfor kan studere regulatoriske mekanismer og identifisere romanen regulatorer for mitokondrie funksjon gi innsikt som kan brukes til å utvikle nye terapeutisk mål for behandling av hjertesykdommer. Her, er hjerte myocyte mitokondrie åndedrett analysert ved hjelp av en unik celle kultur-systemet. Først er en protokoll optimalisert til å raskt finne og kultur høy levedyktighet neonatal musen cardiomyocytes. Deretter brukes en 96-brønns ekstracellulære flux analysator til å vurdere oksygen forbruksraten for disse cardiomyocytes. For denne protokollen, vi optimalisert seeding forhold og vist at neonatal musen cardiomyocytes oksygen forbruksraten lett kan vurderes i en ekstracellulære flux analyserer. Til slutt, vi oppmerksom på at våre protokollen kan brukes på større kultur og andre studier, som intracellulær signalering og kontraktile funksjon analyse.
Introduction
For å opprettholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunksjon, må cardiomyocytes opprettholde en konstant tilførsel av cellular energi i form av ATP1. I hjertet genereres ca 95% av ATP mitokondriene, hovedsakelig gjennom oxidative fosforylering, viser at mitokondrier spiller en avgjørende rolle i bioenergetisk i hjertefunksjon2,3. Støtter denne forestillingen er at feilregulering mitokondrie funksjonen kan føre til kardiomyopati og hjertesvikt4,5. Omvendt, gjenopprette mitokondrie funksjonen har vist seg å forbedre hjertefunksjon av sviktende hjerte6,7. Derfor studerer mekanisme mitokondrie bioenergi og identifisere romanen regulatorer av mitokondrie funksjon i cardiomyocytes vil ikke bare avsløre mekanistisk innsikt i cardiac energiproduksjon, men også kunne gi innsikt som vil lede utviklingen av nye terapeutiske mål å behandle hjertesykdommer6,8.
Sammenlignet med hele hjerte, som inneholder en blanding av myocytter og ikke-myocytter9, cardiomyocyte kulturer er svært ren, med minimal forurensning av ikke-myocytter fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. I tillegg kan isolere cardiomyocytes fra neonatal pups dyrking et stort antall celler i en liten mengde tid, i forhold til skille celler fra voksen hjerter10,11. Viktigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse ganger (f.eks 24 h) og på lengre tid poeng de skille. Neonatal musen cardiomyocytes kan overleve og manipuleres opp 7 dager i kultur, noe som gjør dem ideelle for å teste effekten av stoffet forbindelser og gene manipulasjon funksjonen av mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, det er betydelige biologiske forskjeller mellom voksne og neonatal cellene, men lengre varighet tilgjengelig for kultur neonatal celler gjør dem passer for mange forskjellige typer studier, inkludert de av mitokondrie funksjon.
Hittil har primære kulturperler neonatal musen og rotten cardiomyocytes blitt brukt som modeller for å studere cardiac bioenergi12,13. De siste årene brukt studier en ekstracellulære flux analyserer å måle oksygen forbruksraten (OCR) og evaluere oksidativt kapasitet i musen og rotten neonatale cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, celle levedyktigheten til musen neonatale cardiomyocytes er lavere og har større variasjon16. Også gjør muligheten til å studere celler fra genmodifiserte musen modeller mus celle modell veldig viktig. Gitt at OCR studier er så følsom for tall og seeding tetthet, er utvikling av en reproduserbare, pålitelig og enkel protokoll konsekvent celle avkastning og levedyktighet nødvendig.
Her rapporterer vi et optimalisert protokollen som er utviklet som bruker kulturperler musen neonatale cardiomyocytes sammen med en 96-brønnen-format ekstracellulære flux analysator for OCR analyse. Denne protokollen øker sterkt reproduserbarhet til analysen. I tillegg protokollen ikke bare en roman og reproduserbar metode for OCR analyse, men også kan tilpasses til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, for eksempel det som kan være nødvendig å studere myofibrillære funksjoner og intracellulær signalveier.
Spesielt beskriver denne protokollen en dag fremgangsmåte for isolasjon og kultur neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønns celle kultur plate. I tillegg beskriver fremgangsmåten for å måle oksygenforbruk ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer. Alle løsningene som brukes er sterile eller sterilt filtrert. Alle verktøyene er steriliserte med 75% etanol. Vi tilbyr en Tabell for materiale for ulike deler av prosedyren. For dyrking cardiomyocytes, utføres alle prosedyrer og trinnene i standard celle kultur hette. Denne protokollen er utviklet for isolering av neonatal musen hjerter fra ett kull (ca 8-10 pups). Protokollen kan imidlertid også være tilpasset isolere cardiomyocytes fra mangfoldig søppel.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien har vi etablert en enkel protokoll for å isolere og dyrking musen neonatale cardiomyocytes. Ved å bruke disse cardiomyocytes, optimalisert vi også betingelsene for å måle oksygen forbruksraten ved hjelp av en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gjør det mulig å bruke mus neonatale cardiomyocytes som et modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i de viktigste arbeider cellene av hjertet, som det skulle måles i intakt organ. Våre protokollen er fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbeidet er støttet av American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) og VA fortjeneste (BX003260) til R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
