Анализ скорости потребления кислорода в неонатальной кардиомиоцитов культивировали мыши с помощью анализатора внеклеточного потока
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы проиллюстрировать использование мыши неонатальной cardiomyocytes как модель системы для изучения, как различные факторы могут изменить потребление кислорода в самом сердце.
Abstract
Митохондрии и окислительного метаболизма являются критическими для поддержания функции сердечной мышцы. Исследования показали, что митохондриальной дисфункции является важным фактором для нарушения функции сердца, в сердечной недостаточности. Контрастом восстановление дефектных митохондриальной функции может иметь благоприятные последствия для улучшения сердечной функции, в противном случае сердце. Таким образом изучая механизмы регулирования и выявления роман регуляторы для функции митохондрий может обеспечить понимание, которые могут быть использованы для разработки новых терапевтических целей для лечения болезни сердца. Здесь сердечной myocyte митохондриальное дыхание анализируется с использованием системы культуры уникальный клеток. Во-первых протокол был оптимизирован для быстро изолировать и культура высокой жизнеспособности новорожденного мыши кардиомиоцитов. Затем анализатор внеклеточного поток 96-луночных формат используется для оценки норма расхода кислорода этих кардиомиоцитов. Для этого протокола мы оптимизирована посева условий и продемонстрировал, что темпы потребления кислорода кардиомиоцитов неонатальной мыши можно легко оценивать внеклеточного потока анализатора. Наконец мы отмечаем, что наш протокол может быть применен к большим размером культуры и другие исследования, такие как внутриклеточной сигнализации и сократительной функции анализа.
Introduction
Для поддержания непрерывной сократительной функции сердца, кардиомиоцитов должны поддерживать постоянную поставку клеточной энергии в виде АТФ1. В самом центре около 95% АТФ генерируется митохондрий, главным образом через окислительное фосфорилирование, показаны, что митохондрии играть решающую роль биоэнергетический в сердечной функции2,3. Поддерживая это понятие, что dysregulation митохондриальной функции может привести к сердечной недостаточности и кардиомиопатия4,5. И наоборот, восстановление функции митохондрий было показано для улучшения сердечной функции неисправного сердце6,7. Таким образом изучая механизм митохондриальной биоэнергетики и выявления роман регуляторы митохондриальной функции в cardiomyocytes будет не только выявить механистический идеи производства сердечной энергии, но также может обеспечить понимание того, что приведет для развития новых терапевтических целей для лечения заболеваний сердца6,8.
По сравнению с всем сердцем, который содержит смесь миоцитов и не миоцитах9, cardiomyocyte культур очень чистый, с минимальным загрязнением не миоцитах от сердца, таких как фибробластов и эндотелиальных клеток10. Кроме того изоляция кардиомиоцитов из новорожденных щенков позволяет культивирование большое количество клеток в небольшом количестве времени, по сравнению с переключательным клетки от взрослых сердец10,11. Самое главное культивированный взрослых мыши кардиомиоцитов имеют короткие выживания раз (например, 24 ч) и на длительное время точек де продифференцируйте. Cardiomyocytes новорожденных мыши может выжить и манипулировать для свыше 7 дней в культуре, что делает их идеальными для тестирования воздействия наркотиков соединений и генные манипуляции на функцию митохондрий в cardiomyocytes10. Конечно Существуют значительные биологические различия между клетками взрослых и новорожденных, но дольше продолжительность культуре клеток новорожденных делает их подходящими для различных типов исследований, в том числе митохондриальной функции.
На сегодняшний день основной культурный новорожденных крыс и мышей кардиомиоцитов используются в качестве модели для изучения сердца Биоэнергетика12,13. В последние годы исследования используется анализатор внеклеточного потока для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и оценки окислительного потенциала в мышь и крыса неонатальной кардиомиоцитов14,15. Хотя по сравнению с крысами, жизнеспособность клеток новорожденных кардиомиоцитов мыши ниже и имеет большую изменчивость16. Кроме того возможность изучать клетки генетически модифицированные мыши модели делает ячеечная модель мыши очень важно. Учитывая, что OCR исследования настолько чувствительны к ячейке количество и плотность посева, необходима разработка воспроизводимых, надежной и простой протокол для достижения последовательного клеток урожайность и жизнеспособности.
Здесь мы приводим оптимизированный протокол, который был разработан, который использует культивировали мыши неонатальной кардиомиоцитов наряду с 96-хорошо формат внеклеточного потока анализатор для анализа OCR. Этот протокол значительно увеличивает воспроизводимость анализа. Кроме того протокол не только обеспечивает Роман и воспроизводимый метод для анализа OCR, но также могут быть адаптированы к культуре большего размера для других экспериментальных целей, например, которые могут быть необходимы для изучения миофибрилл функций и внутриклеточной сигнальные пути.
В частности этот протокол описывает один день процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов неонатальной мыши в пластине культуры 96-луночных клеток. Кроме того он описывает процедуру для измерения потребления кислорода с помощью анализатора внеклеточного потока. Все решения, используемые в стерильную или стерильной фильтрации. Все инструменты стерилизуются, 75% этанола. Мы предоставляем Таблицу материалов для различных частей процедуры. Для культивирования кардиомиоцитов, все процедуры и шаги выполняются в капюшоне культуры стандартной ячейки. Этот протокол разработан для изоляции сердца новорожденных мыши из одного помета (примерно 8-10 щенков). Однако протокол также может быть адаптирована для изоляции кардиомиоцитов из нескольких пометов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы создали простой протокол для изоляции и культивирования мыши неонатальной кардиомиоцитов. Используя эти кардиомиоцитов, мы также оптимизировали условий для измерения скорости потребления кислорода с помощью системы анализатора внеклеточного потока. Протокол …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех Росс лаборатории и лаборатории членов Мерфи. Эта работа поддерживается американской ассоциации сердца (14SDG17790005) клуба NIH (HL115933, HL127806) и заслуги ва (BX003260) для R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
