Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular
Summary
El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.
Abstract
Mitocondrias y metabolismo oxidativo son críticos para mantener la función del músculo cardiaco. Investigaciones han demostrado que la disfunción mitocondrial es un factor importante que contribuye al deterioro de la función cardiaco en insuficiencia cardíaca. Por el contrario, la restauración de la función mitocondrial defectuosa puede tener efectos beneficiosos para mejorar la función cardiaca en el corazón de la falla. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de regulación y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial pueden proporcionar la penetración que podría utilizarse para desarrollar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades del corazón. Aquí, la respiración mitocondrial del miocito cardiaco se analiza mediante un sistema de cultivo de célula única. En primer lugar, se ha optimizado un protocolo para aislar rápidamente y cultura alta viabilidad neonatal ratón cardiomiocitos. Entonces, un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos se utiliza para evaluar la tasa de consumo de oxígeno de estos cardiomiocitos. De este protocolo, optimizar las condiciones de siembra y demostró que tasa de consumo de oxígeno de cardiomiocitos de ratón neonatal puede evaluarse fácilmente en un analizador de flujo extracelular. Por último, observamos que nuestro protocolo se puede aplicar a un tamaño más grande de la cultura y análisis de la función de otros estudios, como la señalización intracelular y contráctil.
Introduction
Para mantener una función contráctil cardiaca continua, cardiomiocitos deben mantener un suministro constante de energía celular principalmente en forma de ATP1. En el corazón, se genera aproximadamente el 95% de ATP por las mitocondrias, principalmente a través de la fosforilación oxidativa, mostrando que las mitocondrias desempeñan un papel crucial de la bioenergético en la función cardiaca2,3. Apoyo a esta noción es que la desregulación de la función mitocondrial puede conducir a cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca4,5. Por el contrario, restauración de la función mitocondrial se ha demostrado para mejorar la función cardiaca de la falla del corazón6,7. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la bioenergética mitocondrial y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial en los cardiomiocitos no sólo revela ideas mecanicistas de la producción energética cardiaca pero también pueden proporcionar la penetración que desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades del corazón6,8.
Comparado con el corazón entero, que contiene una mezcla de miocitos y miocitos no9, cultivos de cardiomiocitos son extremadamente puro, con la mínima contaminación de no miocitos del corazón, tales como fibroblastos y células endoteliales10. Además, aislar los cardiomiocitos de los cachorros neonatales permite cultivar un gran número de células en una pequeña cantidad de tiempo, comparado con el aislamiento de las células de corazones adulto10,11. Lo más importante, ratón adulto culto primario cardiomiocitos tienen supervivencia corta veces (p. ej. 24 h) y en tiempo de puntos de diferencian. Cardiomiocitos neonatales ratón pueden sobrevivir y ser manipulada por más de 7 días en cultivo, lo que es ideal para probar los efectos de los compuestos de drogas y manipulación de genes en la función de la mitocondria en cardiomiocitos10. Por supuesto, existen diferencias biológicas importantes entre las células de adulto y neonatales, pero la duración más larga disponible para el cultivo de células neonatales los hace apropiados para diferentes tipos de estudios, los de la función mitocondrial incluidos.
Hasta la fecha, cardiomiocitos neonatales cultivados primarias de la rata y ratón se han utilizado como modelos para estudiar bioenergética cardíaca12,13. En los últimos años, estudios utilizan un analizador de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar la capacidad oxidativa en ratón y rata cardiomiocitos neonatales14,15. Mientras que en comparación con las ratas, la viabilidad celular de cardiomiocitos neonatales de ratón es menor y tiene una mayor variabilidad16. Además, la capacidad para el estudio de células a partir de modelos de ratón modificados genéticamente hace muy importante el modelo de célula de ratón. Dado que estudios de OCR son tan sensibles a la célula número y densidad de siembra, es necesario el desarrollo de un protocolo simple, reproducible y confiable para lograr la viabilidad y rendimiento constante de la célula.
Aquí, Divulgamos un protocolo optimizado que se ha desarrollado que utiliza ratón cultivados cardiomiocitos neonatales junto con un analizador de flujo extracelular 96-bien-formato para el análisis de OCR. Este protocolo aumenta la reproducibilidad del ensayo. Además, el Protocolo no sólo proporciona un método reproducible para el análisis de OCR y novela, sino que también podría adaptarse a una cultura más grande de tamaño para propósitos experimentales, como la que puede ser necesario estudiar las funciones miofibrilar e intracelular vías de señalización.
En particular, este protocolo describe un procedimiento de un día para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en una placa de cultivo celular de 96 pozos. Además, describe el procedimiento para medir el consumo de oxígeno usando un analizador de flujo extracelular. Todas las soluciones utilizadas son estériles o filtrado estéril. Todas las herramientas son esterilizadas por el etanol del 75%. Le ofrecemos una Tabla de materiales para diferentes partes del procedimiento. Para el cultivo de cardiomiocitos, todos los procedimientos y pasos se llevan a cabo en una campana de la cultura de célula estándar. Este protocolo está desarrollado para el aislamiento de corazones de ratón neonatal de una camada (aproximadamente 8-10 crías). Sin embargo, el protocolo también puede adaptarse para aislar cardiomiocitos de camadas múltiples.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos establecido un protocolo simple para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mediante el uso de estos cardiomiocitos, hemos optimizado también las condiciones para medir la tasa de consumo de oxígeno mediante un sistema de analizador de flujo extracelular. El protocolo permite utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como un modelo de sistema para examinar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en las células principales del trabajo del corazó…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a todo laboratorio Ross y miembros del laboratorio de Murphy. Este trabajo es apoyado por la Asociación Americana del corazón (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) y VA al mérito (BX003260) a R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
