Analysera syre materialåtgången i primära odlade mus Neonatal hjärtmuskelcellerna använder en extracellulär Flux Analyzer
Summary
Målet med detta protokoll är att illustrera hur man använda mus neonatal hjärtmuskelceller som modellsystem för att undersöka hur olika faktorer kan förändra syrgaskonsumtion i hjärtat.
Abstract
Mitokondrier och oxidativ metabolism är kritiska för att upprätthålla hjärtmuskeln funktion. Forskning har visat att mitokondriell dysfunktion är en viktig bidragande faktor till nedsatt hjärtfunktion Funna i hjärtsvikt. Däremot kan återställa defekta mitokondriefunktion ha positiva effekter att förbättra hjärtfunktionen i sviktande hjärtat. Därför kan studerar regleringsmekanismerna och identifiera nya regleringsmyndigheter för mitokondriell funktion ge vägledning som kan användas för att utveckla nya terapeutiska mål för behandling av hjärtsjukdom. Här analyseras hjärt myocyt mitokondriell andning med en unik cellodlingssystem. Först, ett protokoll har optimerats för att snabbt isolera och kultur hög bärkraft neonatal mus hjärtmuskelcellerna. Sedan används en 96 brunnar format extracellulära flux analyzer för att bedöma andelen syre förbrukning av dessa hjärtmuskelcellerna. För detta protokoll, vi optimerad sådd villkor och visat att neonatal mus hjärtmuskelcellerna syre materialåtgången kan bedömas enkelt i en extracellulär flux analyzer. Avslutningsvis noterar vi att vårt protokoll kan tillämpas på en större kultur-storlek och andra studier, till exempel Intracellulär signalering och kontraktila fungera analys.
Introduction
För att upprätthålla en kontinuerlig kontraktila hjärtfunktion, måste hjärtmuskelceller upprätthålla en konstant tillförsel av cellulär energi främst i form av ATP1. I hjärtat genereras cirka 95% av ATP av mitokondrierna, främst genom oxidativ fosforylering, visar att mitokondrierna spelar en avgörande roll för bioenergetiska i hjärtfunktion2,3. Stödja detta begrepp är att dysreglering av mitokondriefunktion kan leda till kardiomyopati och hjärtsvikt4,5. Omvänt, återställa mitokondriefunktion har visat sig förbättra hjärtfunktionen av sviktande hjärta6,7. Därför studera mekanismen av mitokondriell Bioenergetik och identifiera nya regulatorer av mitokondriell funktion i hjärtmuskelcellerna avslöjar inte bara mekanistiska insikter av hjärtats energiproduktion men också kunde ge insikt som kommer att leda till utvecklingen av nya terapeutiska mål att behandla hjärtsjukdomar6,8.
Jämfört med hela hjärtat, som innehåller en blandning av myocyter och icke-myocyter9, hjärtmuskelcellen kulturer är extremt rent, med minimal nedsmutsning av icke-myocyter från hjärtat, såsom fibroblaster och endotelceller10. Dessutom isolera hjärtmuskelcellerna från neonatala valpar möjliggör odling ett stort antal celler i en liten mängd tid, jämfört med att isolera celler från vuxna hjärtan10,11. Viktigast av allt, primära odlade vuxen mus hjärtmuskelcellerna har kort överlevnad gånger (t.ex. 24 h) och på längre tid punkter de differentiera. Neonatal mus hjärtmuskelcellerna kan överleva och manipuleras för uppemot 7 dagar i kultur, vilket gör dem idealiska för att testa effekterna av läkemedelssubstanser och gen manipulation på funktionen av mitokondrier i hjärtmuskelcellerna10. Naturligtvis finns betydande biologiska skillnader mellan de vuxna och neonatal cellerna, men de längre varaktigheten som är tillgängliga för kultur av neonatal celler gör dem lämpliga för många olika typer av undersökningar, inbegripet de av mitokondriell funktion.
Hittills har primära odlade neonatal mus och råtta hjärtmuskelcellerna använts som modeller för att studera hjärt bioenergetik12,13. Under senare år har används studier en extracellulär flux analyzer att mäta syre materialåtgången (OCR) och utvärdera oxidativ kapacitet i mus och råtta neonatal hjärtmuskelcellerna14,15. Även jämfört med råttor, cell livskraft mus neonatal hjärtmuskelcellerna är lägre och har ökad variabilitet16. Dessutom gör möjlighet att studera celler från genetiskt modifierade musmodeller cellen musmodell mycket viktigt. Med tanke på att OCR studier är så känsliga för cell nummer och sådd densitet, behövs utveckling av en reproducerbar, tillförlitlig och enkel protokoll att uppnå konsekvent cell avkastning och lönsamhet.
Vi rapporterar här, ett optimerat protokoll som har utvecklats som använder odlade mus neonatal hjärtmuskelcellerna tillsammans med en 96-brunn-format extracellulära flux analyzer för OCR analys. Detta protokoll ökar kraftigt reproducerbarhet i analysen. Dessutom protokollet inte bara ger en roman och reproducerbar metod för OCR analys, men också kunde anpassas till en större storlek kultur för andra experimentella syften, såsom det som kan vara nödvändiga att studera myofibrillar funktioner och intracellulära signalvägar.
I synnerhet beskriver det här protokollet en endags-förfarande för isolering och kultur av neonatal mus hjärtmuskelcellerna i en platta med 96 brunnar cell i kultur. Dessutom, beskriver den förfarandet för att mäta syreförbrukning som använder en extracellulär flux analysator. Alla lösningar som används är sterila eller steril filtreras. Alla verktyg är steriliserade av 75% etanol. Vi ger en Tabell av material för olika delar av förfarandet. Odlingsskålar hjärtmuskelceller, för utförs alla förfaranden och åtgärder i en vanlig cell kultur huva. Detta protokoll är utvecklat för isolering av neonatal mus hjärtan från en kull (ca 8-10 ungar). Protokollet kan dock också anpassas för att isolera hjärtmuskelcellerna från flera kullar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie har vi etablerat ett enkelt protokoll för isolera och odla mus neonatal hjärtmuskelcellerna. Genom att använda dessa hjärtmuskelceller, optimerad vi också förutsättningar för att mäta syre materialåtgången genom att använda ett extracellulära flux analyzer system. Protokollet tillåter en att använda mus neonatal hjärtmuskelcellerna som modellsystem för att undersöka hur olika faktorer kan förändra syreförbrukning i huvudsakliga fungerande celler i hjärtat, besläktad med vad som skull…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka alla Ross lab och Murphy lab medlemmar. Detta arbete stöds av American Heart Association (14SDG17790005) till YC NIH (HL115933, HL127806) och VA Merit (BX003260) till R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
