フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70
Summary
ここでは、高感度で非放射性トレーサーを用いてマウスの糸球体透過性を試験するプロトコルを提示する。この方法は、小さな尿量で反復的な尿分析を可能にします。
Abstract
尿中のアルブミンの損失(アルブミン尿)は、心血管の結果を予測します。生理学的条件下では、少量のアルブミンを糸球体で濾過し、吸収限界に達するまで管状系で再吸収する。病理学的アルブミン濾過の早期増加は、したがって、アルブミン尿を分析することによって見逃されがちである。したがって、糸球体パーマ選択性をテストするためにトレーサーを使用することは有利と思われる。蛍光標識標識フッ素イソチオシアネート(FITC)-ポリスクロース(すなわち、FITC-Ficoll)は、糸球体透過性を研究するために使用することができる。FITC-ポリスクロース分子は糸球体によって自由に濾過されるが、管状系では再吸収されない。マウスおよびラットにおいて、FITC-ポリスクロースは、技術的に複雑な手順(すなわち、放射性測定、高性能液体クロマトグラフィー[HPLC]、ゲル濾過)を用いて糸球体透過性のモデルで調査されている。我々は、マウスにおけるFITC-ポリスクロース70(アルブミンのサイズ)に対する糸球透過性の早期および小さな増加をテストするために、FITC-ポリスクローストレーサーベースのプロトコルを改変し、促進した。この方法は小さい尿容積(5 μL)の反復的な尿の分析を可能にする。このプロトコルは、トレーサーFITC-ポリスクロース70が静脈内に適用され、尿が単純な尿カテーテルを介して収集される方法に関する情報を含む。尿は蛍光プレートリーダーを介して分析され、尿濃度マーカー(クレアチニン)に正規化され、技術的に複雑な手順を回避します。
Introduction
糸球体濾過バリア内の機能的または構造的欠陥は、アルブミンに対する糸球透過性を増加させ、尿中のアルブミンの検出(アルブミン尿)をもたらす。アルブミン尿は心血管の転帰を予測し、糸球体損傷1の重要なマーカーである。アルブミン尿の低レベルでさえ、正常範囲内に横たわって、増加した心血管リスク1に関連している。
生理学的条件下では、アルブミンは糸球体を通して濾過され、管状システム2、3でほぼ完全に再吸収される。マウスでは、尿中のアルブミンの検出は、通常、尿採取の24時間からアルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行われる。24時間の尿採取またはスポット尿からの尿を使用すると、アッセイ感受性の問題のためにアルブミン濃度の小さな違いが見逃される可能性があります。したがって、ほとんどの研究者は、毒素、薬物、腎外科による強い腎損傷によってアルブミン尿が誘発される動物モデルを使用する。
したがって、糸球体透過性の小さくて一過性の変化を検出する敏感な方法の発見は、フィールドにとって非常に重要である。Rippeらは、蛍光標識トレーサー、すなわちFITC-ポリスクロース70(すなわち、FITC-Ficoll 70)をアルブミン4の大きさで適用することにより、糸球体透過性を試験するラットモデルを提示した。トレーサーアプリケーションは、糸球体透過性(数分以内)の短期的な変化のテストを可能にし、非常に敏感な4.2つの研究は、マウス5、6でトレーサー法を使用している。その利点にもかかわらず、この方法は、残念ながら、欠点を持っています:それは技術的に非常に複雑で、放射性、および侵襲的です。尿のさらなる分析は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLC5、6を用いてのみ行う。
本論文では、蛍光標識FITC-ポリスクロース70を用いてマウスの糸球体透過性を測定する代替的、敏感、非放射性、および高速方法を提示する。経尿道カテーテルを導入することにより、尿採取は膀胱穿刺、尿道切除術、および上腹部カテーテル塗布よりも侵襲性が低く、少なくとも30分毎に尿採取が可能である。蛍光プレートリーダー。尿中のトレーサー濃度は、酵素クレアチニンアッセイを使用して尿中のクレアチニン濃度に正規化される。
したがって、この新しい方法は、糸球体透過性の増加と早期糸球体損傷を研究するための敏感なツールを提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法は、研究者がトレーサーを使用して非常に敏感な方法でマウスの糸球体透過性をテストすることを可能にする。この方法では、糸球体透過性の短期的な増加は、少量の尿のみを使用して診断することができる。この技術をうまくマスターするための最も重要なステップは、1)マウス手術、特に中枢静脈のカナンテーションにおける手動専門知識の開発、2)粘膜に害を与えること…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、クリスティーナ・シュヴァント、ブランカ・デュヴンジャク、ニコラ・クルに対し、卓越した技術支援と、蛍光スキャンに関する彼の助けに対するデニス・ソーン博士に感謝しています。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)SFB 612 TP B18のL.C.R.およびL.S.への助成金によって支えられた。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
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