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Recherche en cancérologie

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

Published: August 04, 2019
doi:
10.3791/59071
, , , , ,
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit,Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO,University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy,University of Porto

Summary

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

Abstract

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

Introduction

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다1 . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고3,4로요약된다.

상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다5. 6개 , 7.전사 계통 8의 기저 성분의진화적 보존으로 인해 많은 인간 FFs(효모 세포에서 ectopically 발현시)는 프로모터를 통해 작용하여 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 적절한 REs를 포함합니다. 인간 P53에 대해 여기에 제시된 전사 모델 시스템은 그 효과를 변조할 수 있는 세 가지 주요 변수를 특징으로 한다: 1) P53의 발현 및 유형의 양상, 2) P53 의존적 전사를 제어하는 RE 서열, 및 3) 리포터 유전자(그림1A).

P53 발현의 양상에 관하여, S. cerevisiae는 유도성, 억압적, 또는 구성적인프로모터의 선택을 허용한다 9,10,11. 특히, 유도성 GAL1 프로모터는 효모에서 TF의 기저(라피노스를 탄소원으로 사용) 또는 가변(매체 내의 갈락토의 양을 변화시킴으로써) 발현을 허용한다. 실제로, 미세조정가능한 발현은 P53 자체뿐만 아니라 다른 P53 패밀리 단백질12,13을연구하기 위한 중요한 발전을 나타낸다.

P53 의존식을 제어하는 R의 유형에 관해서는, S. cerevisiae그렇지 않으면 등소성 배경에 관심의 RE에 독특한 차이를 소유하는 다른 기자 균주의 건설을 할 수 있습니다. 이러한 목표는 델리토 페르페토12, 14, 15,16에서개발된 특히 다재다능한 게놈 편집 접근법의 적응을 이용하여 도달한다.

더욱이, 상이한 리포터 유전자(즉, URA3, HIS3 및 ADE2)는 S. cerevisiae에서인간 FF의 전사 활동을 질적 및 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있으며, 각각 특정 기능을 가지고 있을 수 있습니다. 실험적 필요에맞게 17,18,19,20,21. 이 리포터 유전자의 발현은 각각 우라실, 히스티딘 및 아데닌 프로토위트로피를 부여합니다. URA3 리포터는 5-FOA가 있는 세포의 성장을 허용하지 않으므로 역선택될 수 있습니다. ADE2 리포터 시스템은 영양 선택 외에도 야생형(즉, ADE2 발현에서 기능적) 또는 돌연변이(즉,ADE2에서 기능적이지 않음)를 발현하는 효모 세포를 식별할 수 있다는 장점이 있습니다. ) 식민지 색상에서 P53.

예를 들어, ADE2 유전자를 발현하는 효모 세포는 아데닌(2.5-5.0 mg/L)을 제한하는 플레이트에 보통 크기의 백색 식민지를 생성하는 반면, 제대로 또는 전사하지 않는 세포는 더 작은 빨간색(또는 분홍색)과 같은 플레이트에 나타납니다. 식민지. 이것은 아데닌 생합성 통로에 있는 중간의 축적 때문입니다 (즉, P-ribosylamino-imidazole, 이전에 는 아미노-이미다졸 리보티드 또는 AIR라고 불렸습니다), 이는 적색 안료를 형성하기 위하여 변환됩니다. 질적 색계 ADE2 리포터 유전자는 이후 양적 반딧불 Photinus pyralis (LUC1)12,22로대체되었다. 최근에는 ADE2 리포터가 lacZ 리포터와 결합하여 점수가 매편, 반정적, 이중 리포터 분석으로 P53 돌연변이체의 잔류 수준에 따라 하위 분류에 악용될 수 있습니다. 23.

EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) 또는 DsRed (디스코소마 sp. 적색 형광 단백질)와 같은 형광 기자는 또한 가능한 모든 오센스 돌연변이와 관련된 트랜스 활성화 활성의 정량적 평가에 사용되어 왔다. TP53 코딩 시퀀스24. 마지막으로, RE 및/또는 리포터 유전자에 대해 다른 이소제닉 효모 균주와 P53 알레일 발현을 위한 튜닝 가능한 프로모터를 결합할 수 있는 기회는 암 관련 및 생식선의 정제된 분류를 생성하는 데이터 매트릭스의 발달로 이끌어 냈습니다. 돌연변이 P53 대두25,26,27.

전술한 접근법은 P53 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 효모 S. 세레비시아28 및 척수사카로마이스폼베(29)에서 야생형 P53의 발현은 세포주기 검거28,30 또는 세포주기와 연관된 성장 지연을 유발할 수 있다. 세포 죽음31. 두 경우 모두, 효모 성장 억제는 높은 P53 발현에 의해 유발되고 세포 성장에 관여하는 내인성 효모 유전자의 잠재적인 전사 변조와 상관관계가 있다. 이러한 가설을 뒷받침하는, 기능 상실 돌연변이P53 R273H는 야생형 P5332와유사한 수준으로 발현될 때 효모 세포 성장을 방해하지 않았다. 반대로, 독성 돌연변이P53 V122A(야생형 P53에 비해 전사 활성이 높은 것으로 공지)의 효모에서발현은 야생형 P5332보다더 강한 성장 억제 효과를 일으켰다.

부가적으로, 인간 MDM2는 효모에서 인간 P53 전사 활성을 억제할 수 있었고, 그 유비퀴틴화 및 후속 분해를 촉진할 수 있었다는 것을 입증하였다33. 이에 따라, 인간 MDM2 및 MDMX가 P53-유도 효모 성장억제를 억제하는 능력을 32,34로입증하였다. 추가 연구에서는, 효모32에있는 ACT1 유전자에 putative P53 RE 상류의 확인과 함께 P53 전사 활성 및 액틴 발현 수준 사이 상관관계가 확립되었다. 일관되게, 액틴 발현은 P53 V122A에 의해 야생형 P53 및 더욱 강화되었지만, 돌연변이 P53 R273H에 의해서는 아니었다. 반대로, P53에 의한 액틴 발현은 효모 성장 분석법에 기초한 결과와 일치하는 P53 억제제 MDM2, MDMX, 또는 피피테린 α(P53 전사 활성의 소분자 억제제)의 공존존재에서 감소하였다. 중요한 것은, 이러한 결과는 P53 유도 성장 억제와 효모에서의 활성 정도 사이의 상관 관계를 확립했으며, 이는 또한 P53 기능을 변조하는 소분자를 식별하고 연구하기 위해 악용되어 왔다28,34 , 35.

Protocol

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE) 줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 표1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%?…

Representative Results

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주 델리토 퍼페토접근법12,14,15,16은 P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도<strong class…

Discussion

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 유럽 연합 (FEDER 기금 POCI/01/0145/FEDER/007728 Programa 오페라 팩터드 드 경쟁) 및 국가 기금 (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia 및 Ministério da Educação e Ciência) 파트너십 계약 PT2020 UID/QUI/50006/2019 및 프로젝트(3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 – POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT 펠로우십: SFRH/BD/96189/2013 (S. 고메스). 이 작품은 Compagnia S. Paolo, 토리노, 이탈리아 (프로젝트 2017.0526)와 보건부 (프로젝트 5×1000, 2015 및 2016; 현재 연구 2016)에 의해 지원되었습니다. 테레사 로페즈-아리아스 몬테네그로 박사(트렌토 대학교, 실험 과학 교육 실험실)에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 대해 깊이 감사드립니다.

Materials

L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500
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Keywords: YeastP53TranscriptionReporter GeneAdenine-2Firefly LuciferaseLithium AcetateTransformationPCRSanger SequencingTransactivationColor-based Assay
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Citer Cet Article
Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).
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