JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

Published: August 04, 2019
doi:
10.3791/59071
, , , , ,
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit,Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO,University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy,University of Porto

Summary

Представлены здесь четыре протокола для создания и эксплуатации дрожжей Saccharomyces cerevisiae репортер штаммов для изучения человека P53 трансактивации потенциал, последствия его различных связанных с раком мутаций, совместно выраженных взаимодействующих белков, и эффекты конкретных малых молекул.

Abstract

Вывод о том, что известный белок P53 млекопитающих может выступать в качестве транскрипции фактор (TF) в дрожжах S. cerevisiae позволило для разработки различных функциональных анализов для изучения воздействия 1) связывающий сайт (т.е., элемент ответа (RE) варианты последовательности на P53 трансактивации специфичности или 2) TP53 мутации, совместно выраженные кофакторы, или небольшие молекулы на P53 трансактивации деятельности. Разработаны различные базовые и трансляционные исследовательские приложения. Экспериментально эти подходы используют два основных преимущества модели дрожжей. С одной стороны, простота редактирования генома позволяет быстро строить качественные или количественные системы репортера, используя изогенные штаммы, которые отличаются только на уровне конкретного P53-RE для изучения последовательности-специфическости P53-зависимых трансактивации. С другой стороны, наличие регулируемых систем эктопического выражения P53 позволяет оценивать трансактивацию в широком диапазоне экспрессии белка. Рассмотрены в этом докладе широко используются системы, которые основаны на генах цвет репортера, люциферазе и росте дрожжей, чтобы проиллюстрировать их основные методологические шаги и критически оценить их прогностической силы. Кроме того, крайняя универсальность этих подходов может быть легко использована для изучения различных TFs, включая P63 и P73, которые являются другими членами семейства генов TP53.

Introduction

Транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим динамическую, пространственную и временную организацию транскрипционных факторов (ТФ) и кофакторов для набора и модуляции РНК-полимераз на хроматиновых регионах в ответ на специфические стимулы1 . Большинство TFs, в том числе человека P53 супрессор опухоли, признают конкретные цис-действующих элементов в виде последовательностей ДНК, называемых ответных элементов (REs), которые состоят из одного (или несколько) уникальных мотивов 6-10 нуклеотидов долго. В рамках этих мотивов, отдельные позиции могут показать различные степени изменчивости2, как правило, суммируется по позиции вес матрицы (PWM) или логотипы3,4.

Дрожжи S. cerevisiae является подходящей модельной системой для изучения различных аспектов человеческих белков через дополнения анализы, эктопические выражения, и функциональные анализы, даже если ортололожный дрожжевой ген не присутствует5, 6 , 7. Из-за эволюционного сохранения базальных компонентов транскрипционной системы8, многие человеческие TFs (когда эктопически выражается в дрожжевых клетках) может модулировать выражение гена репортера, действуя через промоутеров инженерии содержат соответствующие REs. Система транскрипционной модели, представленная здесь для человека P53, характеризуется тремя основными переменными, эффекты которых могут быть модулированы: 1) модальность выражения и тип P53, 2) re последовательность управления P53-зависимой транскрипции, и 3) тип ген репортера(рисунок 1A).

Что касается модальности выражения P53, S. cerevisiae позволяет выбирать индуцируемую, репрессивную или составную промоутеров9,10,11. В частности, индуцированный промоутер GAL1 позволяет базальный (используя раффиноз в качестве источника углерода) или переменной (путем изменения количества галактозы в средствах массовой информации) выражение TF в дрожжах. В самом деле, тонко настраиваемый выражение представляет собой критическое развитие для изучения не только P53 себя, но и другие белки семьи P5312,13.

Что касается типа REs, контролирующего P53-зависимое выражение, S. cerevisiae позволяет строить различные штаммы репортера, обладающие уникальными различиями в RE интереса в ином изогенном фоне. Эта цель достигается с помощью адаптации особенно универсальный подход к редактированию генома, разработанный в S. cerevisiae, называется delitto perfetto12,14,15,16.

Кроме того, различные гены репортеров (т.е. URA3, HIS3 и ADE2) могут быть использованы для качественной и количественной оценки транскрипционной деятельности человека TFs в S. cerevisiae, каждый с конкретными особенностями, которые могут быть адаптированы к экспериментальным потребностям17,18,19,20,21. Выражение этих генов репортера придает uracil, гистидин, и аденина прототрофии, соответственно. Репортер URA3 не позволяет рост клеток в присутствии 5-FOA, а также, и, таким образом, он может быть противопоставить. Система репортеров ADE2 имеет то преимущество, что, помимо выбора питательных веществ, она позволяет идентифицировать дрожжевые клетки, которые выражают дикий тип (т.е. функциональный на экспрессии ADE2) или мутант (т.е.не функциональный на ADE2 ) P53 из колонии цвета.

Например, дрожжевые клетки, выражающие ген ADE2, генерируют белые колонии нормального размера на пластинах, содержащих ограничивающие количества аденина (2,5-5,0 мг/л), в то время как те, которые плохо или не транскрибируют, появляются на той же пластине, что и меньший красный (или розовый) Колонии. Это связано с накоплением промежуточного в аденина биосинтетических пути (т.е. P-рибосиламино-имидазол, который ранее был назван амино-имидазол риботид или AIR), который преобразуется в форме красного пигмента. Качественный цвет на основе ADE2 репортер ген с тех пор был заменен на количественные Светлячок Photinus пиралис (LUC1)12,22. Совсем недавно репортер ADE2 был объединен с репортером лака в простой в оценке, полуколичественный, двойной репортер ассс, который может быть использован для подкласса класса P53 мутантов в соответствии с их остаточным уровнем функциональности 23.

Флуоресцентные репортеры, такие как EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) или DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), также использовались для количественной оценки трансактивационной активности, связанной со всеми возможными мутациями неправильности в TP53 последовательность кодирования24. Наконец, вероятность объединения настраиваемых промоутеров для экспрессии аллелей P53 с изогенными штаммами дрожжей, отличающимися для гена RE и/или репортера, привела к разработке матрицы данных, которая генерирует уточненную классификацию связанных с раком и зародышевых мутант P53 аллели25,26,27.

Описанные выше подходы используются для измерения транскрипционной активности белка P53. Тем не менее, выражение дикого типа P53 в дрожжах S. cerevisiae28 и Schizosaccharomyces pombe29 может вызвать замедление роста, которое было связано с арестом клеточного цикла28,30 или клеточная смерть31. В обоих случаях ингибирование роста дрожжей вызвано высоким выражением P53 и коррелирует с потенциальной транскрипционной модуляцией эндогенных дрожжевых генов, участвующих в росте клеток. Поддерживая эту гипотезу, потеря функции мутант P53 R273H не вмешиваться в рост дрожжевых клеток, когда выражается на аналогичных уровнях, как дикий тип P5332. И наоборот, выражение в дрожжах токсичного мутанта P53 V122A (известный более высокой транскрипционной активностью по сравнению с диким типом P53) вызвало более сильный тормозной эффект роста, чем дикий тип P5332.

Кроме того, было продемонстрировано, что человек MDM2 был в состоянии ингибировать человека P53 транскрипционной активности в дрожжах, способствуя его убиквиции и последующей деградации33. Соответственно, способность человека MDM2 и MDMX ингибировать P53-индуцированного ингибирования роста дрожжей было продемонстрировано32,34. В дополнительном исследовании, корреляция между P53 транскрипционной активности и уровней экспрессии актина была установлена, с определением предполагаемых P53 RE вверх по течению на гене ACT1 в дрожжах32. Последовательно, экспрессия актина была усилена диким типом P53 и тем более P53 V122A, но не мутантом P53 R273H. И наоборот, экспрессия действия P53 уменьшилась в со-присутствии ингибиторов P53 MDM2, MDMX, или пифитрин-З (маломолекулярный ингибитор транскрипционной активности P53), согласующиеся с результатами, основанными на оценке роста дрожжей. Важно отметить, что эти результаты установили корреляцию между P53-индуцированной ингибирования роста и степень его активности в дрожжах, который также был использован для выявления и изучения малых молекул, модулирующих Функции P5328,34 , 35.

Protocol

1. Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов, содержащих конкретные RE (yAFM-RE или yLFM-RE) Полоса yAFM-ICORE или yLFM-ICORE штамм12,14 (ICORE I, ISce-I эндонуклеаз под GAL1 промоутер; CO – счетчик выбираемый URA3; RE – репортер KanMX4, дающий сопротивление …

Representative Results

Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов Delitto perfettoapproach12,14,15,16 был адаптирован для строительства …

Discussion

Дрожжи на основе анализов оказались полезными для изучения различных аспектов функций белка P53. Эти анализы особенно чувствительны для оценки потенциала трансактивации P53 по отношению к вариантам целевых объектов RE, включая оценку функциональных полиморфизмов. Использование цветных …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Европейский союз (FedER средств POCI/01/0145/FEDER/007728 через Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE) и национальные фонды (FCT/MEC, Funda’o пара Ci’ncia e Tecnologia и Министерио да Эдукао э Ciincia) в соответствии с Соглашение о партнерстве PT2020 UID/Куи/50006/2019 и проекты (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 – POCI-01-0145-FEDER-016581. Стипендии ФСТ: SFRH/BD/96189/2013 (С. Гомес). Эта работа была поддержана Компанией С. Паоло, Турин, Италия (проект 2017.0526) и Министерством здравоохранения (Проект 5×1000, 2015 и 2016; текущие исследования 2016). Мы глубоко благодарим д-ра Терезу Лопес-Ариас Черногорию (Университет Тренто, учебные лаборатории экспериментальных наук) за помощь в видеозаписи.

Materials

L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Recherche en cancérologie. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

Tags

Keywords: YeastP53TranscriptionReporter GeneAdenine-2Firefly LuciferaseLithium AcetateTransformationPCRSanger SequencingTransactivationColor-based Assay
check_url/fr/59071?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image