Méthode d'empalement de microélectrode pour enregistrer le potentiel de membrane d'une artère cérébrale moyenne cannulated
Summary
L’objectif principal de cet article est de fournir des détails sur la façon d’enregistrer le potentiel membranaire (Vm) de l’artère cérébrale moyenne en utilisant la méthode d’impalement de microélectrode. L’artère cérébrale moyenne cannulated est équilibrepour obtenir le tonus myogénique, et la paroi du vaisseau est empalé à l’aide de microélectrodes à haute résistance.
Abstract
Le potentiel membranaire (Vm) des cellules musculaires vasculaires lisses détermine le tonus des vaisseaux et donc le flux sanguin vers un organe. Les changements dans l’expression et la fonction des canaux ioniques et des pompes électrogéniques qui régulent Vm dans les conditions de la maladie pourraient potentiellement altérer Vm, tonalité vasculaire, et le flux sanguin. Ainsi, une compréhension de base de l’électrophysiologie et les méthodes nécessaires pour enregistrer avec précision Vm dans des états sains et malades sont essentiels. Cette méthode permettra de moduler Vm à l’aide de différents agents pharmacologiques pour restaurer Vm. Bien qu’il existe plusieurs méthodes, chacune avec ses avantages et ses inconvénients, cet article fournit des protocoles pour enregistrer Vm à partir de vaisseaux de résistance cannulés tels que l’artère cérébrale centrale en utilisant la méthode d’empalement de microélectrode. Les artères cérébrales moyennes sont autorisées à obtenir un tonus myogénique dans une chambre myographique, et la paroi du vaisseau est empalée à l’aide de microélectrodes à haute résistance. Le signal Vm est recueilli à l’aumoyen d’un électromètre, numérisé et analysé. Cette méthode fournit une lecture précise du Vm d’une paroi de navire sans endommager les cellules et sans changer la résistance de membrane.
Introduction
Le potentiel membranaire (Vm) d’une cellule se réfère à la différence relative de charge ionique à travers la membrane plasmatique et à la perméabilité relative de la membrane à ces ions. Le Vm est généré par la distribution différentielle des ions et est maintenu par des canaux ioniques et des pompes. Les canaux ioniques tels que K ,NaetCl contribuent substantiellement au vmau repos . Les cellules musculaires vasculaires et lisses (VSMC) expriment plus de quatre types différents de canaux K1, deux types de canaux Ca 2(VGCC) (VGCC)2, plus de deux types de canaux Cl 3, 4 ( en plus) , 5, canaux Ca2 mD exploités en magasin6, canaux de cation à activation extensible7,8, et pompes ATPase de sodium-potassium électrogéniques9 dans leurs membranes plasmatiques, qui peuvent toutes être impliqués dans la réglementation de Vm.
Le Vm des VSMC dépend de la pression lumineuse. Dans les navires non pressurisés, Vm varie de -50 à -65 mV, cependant, dans les segments artériels pressurisés, Vm varie de -37 à -47 mV10. L’élévation de la pression intravasculaire provoque des VSMC pour dépolariser11, diminue le seuil pour l’ouverture de VGCC, et augmente l’afflux de calcium contribuant au développement du tonique myogénique12. Au contraire, dans les vaisseaux passifs ou non pressurisés, l’hyperpolarisation membranaire, due à une activité élevée du canal K, empêchera le VGCC de s’ouvrir, ce qui entraînera une entrée limitée de calcium et une diminution du calcium intracellulaire, contribuant à moins tonalité vasculaire13. Ainsi, Vm en raison de changements dans la pression lumen semble jouer un rôle essentiel dans le développement du tonalité vasculaire, et les deux vGCC et Kcanaux jouent un rôle crucial dans la réglementation de Vm.
Vm varie selon le type de navire et les espèces. Vm est de -54 à 1,3 mV dans les bandes artérielles mésentériques supérieures supérieures de cobaye14,-45 – 1 mV dans les artères cérébrales moyennes de rat à la pression lumen de 60 mmHg12,et -35 – 1 mV dans les artères parenchymal de rat à la pression lumen de 40 mmHg15. Le Vm au repos enregistré dans le muscle lymphatique non tendu de rat est -48 – 2 mV16. Vm des VSMC cérébraux est plus négatif que dans les artères périphériques. En comparaison, les artères cérébrales moyennes félines ont été rapportées pour avoir unV m d’environ -70 mV, alors que les artères mésentériques et coronaires ont été rapportées pour avoir -49 et -58 mV, respectivement17,18. Les différences dans leV m à travers les lits vasculaires peuvent refléter les différences dans l’expression et la fonction des canaux ioniques et des pompes électrogéniques sodium-potassium.
Les augmentations et les diminutions de Vm sont appelées dépolarisation et hyperpolarisation membranaires, respectivement. Ces altérations dans Vm jouent un rôle central dans de nombreux processus physiologiques, y compris le gating ion-canal, la signalisation cellulaire, la contraction musculaire, et la propagation potentielle d’action. À une pression fixe, de nombreux composés vasodilatateurs endogènes et synthétiques qui activent les canaux K causent l’hyperpolarisation de la membrane, entraînant une vasodilatation1,13. Inversement, la dépolarisation soutenue de membrane est essentielle dans la vasoconstriction agoniste-induite ou réceptrice-négociée19. Vm est une variable critique qui non seulement réglemente l’afflux de Ca2 par le biais de VGCC13, mais influence également la libération de Ca2 ‘des magasins internes20,21 et Ca2-sensibilité de l’appareil contractuel22.
Bien qu’il existe plusieurs méthodes pour enregistrer Vm de différents types de cellules, les données recueillies à partir de la méthode d’empalement des microélectrodes des vaisseaux cannulés semblent être plus physiologiques que les données obtenues à partir de VSMC isolés. Lorsqu’il est enregistré à partir de VSMC isolés à l’aide des méthodes actuelles de pince, Vm est considéré comme des hyperpolarisations transitoires spontanées dans les VSMC24. Les VSMC isolés ne sont pas dans le syncytium, et les changements dans la résistance de série peuvent contribuer au comportement oscillatoire de Vm. D’autre part, le comportement oscillatoire n’est pas observé lorsque Vm est enregistré à partir de vaisseaux intacts, probablement en raison du contact cellule-cellule entre les VSMC qui sont en syncytium dans l’artère et sont résumés dans tout le navire menant à un Vm stable 24. Ainsi, la mesure de Vm des vaisseaux pressurisés utilisant la technique standard d’empalement de microélectrode est relativement proche des conditions physiologiques.
L’enregistrement de Vm à partir de vaisseaux cannulés pourrait fournir des informations vitales, puisque Vm de VSMC s’il est en syncytium est l’un des principaux déterminants du tonience vasculaire et du flux sanguin, et la modulation duV m pourrait fournir un moyen de dilater ou constrictent les vaisseaux sanguins. Il est donc essentiel de comprendre la méthodologie impliquée dans l’enregistrement de Vm. Cet article décrit l’enregistrement intracellulaire de Vm des artères cérébrales moyennes cannulated (MCAs) utilisant une méthode d’empalement de microélectrode. Ce protocole décrira comment préparer les MCA, les microélectrodes, mettre en place l’électromètre et effectuer la méthode d’empalement pour enregistrer Vm. En outre, les données représentatives, les questions communes qui ont été rencontrées lors de l’utilisation de cette méthode et les questions potentielles sont discutées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article fournit les étapes nécessaires sur la façon d’utiliser une méthode d’empalement de microélectrode forte pour enregistrer Vm à partir d’une préparation de navire cannulated. Cette méthode est largement utilisée, et offre des enregistrements cohérents de haute qualité de Vm qui répondent à un large éventail de questions expérimentales.
Certaines considérations critiques et des étapes de dépannage sont décrites ici pour assurer le succès de la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés en partie par des subventions du programme de recherche de soutien intra-muros (IRSP) de l’UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) accordéeà Mallikarjuna R. Pabbidi.
Materials
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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