Microelectrode Impalement metode for å Record membran potensial fra en Kanylert Middle cerebral arterie

Summary

Hovedmålet med denne artikkelen er å gi detaljer om hvordan å registrere membran potensial (V_m) fra midten cerebral arterien ved hjelp av microelectrode impalement metoden. Den kanylert midten cerebral arterien er equilibrated å få myogenic tone, og fartøyet veggen er Impaled ved hjelp av høy motstand microelectrodes.

Abstract

Membran potensial (V_m) av vaskulære glatte muskelceller bestemmer fartøyets tone og dermed blodstrømmen til et organ. Endringer i uttrykket og funksjon av ion kanaler og electrogenic pumper som regulerer V_m i sykdomstilstander potensielt kan endre v_m, vaskulær tone, og blodstrøm. Således, en grunnleggende forståelse av elektrofysiologi og de metoder som er nødvendige for å nøyaktig registrere V_m i sunne og syke stater er avgjørende. Denne metoden vil tillate modulerende V_m bruke ulike farmakologiske midler for å gjenopprette V_m. Selv om det er flere metoder, hver med sine fordeler og ulemper, gir denne artikkelen protokoller for å spille inn V_m fra kanylert motstand fartøy som midten cerebral arterien ved hjelp av microelectrode impalement metoden. Middle cerebral arterier får lov til å få myogenic tone i en myograph kammer, og fartøyet veggen er Impaled ved hjelp av høy motstand microelectrodes. V_m signalet samles inn gjennom en electrometer, digitalisert og analysert. Denne metoden gir en nøyaktig lesning av V_m av en fartøy vegg uten å skade cellene og uten å endre membran motstanden.

Introduction

Membranen potensialet (V_m) av en celle refererer til den relative forskjellen av ioniske lade over plasma membranen og den relative permeabilitet av membranen til disse ioner. V_m er generert av differensial fordeling av ioner og vedlikeholdes av ion kanaler og pumper. Ion-kanaler som K⁺, na⁺og CL⁻ bidrar vesentlig til hvile V_m. Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) uttrykke mer enn fire forskjellige typer av K⁺ kanaler¹, to typer spenning-gated ca^{2 +} kanaler (VGCC)², mer enn to typer CL-kanaler ^{3, 4} andre priser ^{, 5}, butikk-opererte ca^{2 +} kanaler⁶, strekk-aktivert spesifiserer kanaler^7,8, og electrogenic natrium-kalium ATPase pumper⁹ i sine plasma membraner, som alle kan være involvert i regulering av V_m.

V_m av VSMCs avhenger av lumen trykk. I beholdere uten trykk, varierer V_m fra-50 til-65 mv, men i trykk arterie segmenter, V_m spenner fra-37 til-47 mv¹⁰. Heving av intravaskulær trykk forårsaker VSMCs til depolarize¹¹, reduserer TERSKELEN for VGCC åpning, og øker kalsium tilstrømningen bidra til utvikling av myogenic tone¹². Tvert imot, i passive eller ikke-trykkbeholdere, membran hyperpolarization, på grunn av høy K⁺ kanal aktivitet, vil hindre VGCC fra å åpne, noe som resulterer i begrenset kalsium oppføring og en nedgang i intracellulære kalsium, bidrar til mindre vaskulær tone¹³. Dermed, V_m på grunn av endringer i lumen trykk ser ut til å spille en viktig rolle i vaskulær tone utvikling, og både VGCC og K⁺ kanaler spille en avgjørende rolle i regulering av V_m.

V_m varierer mellom fartøy type og art. V_m er-54 ± 1,3 mv i marsvin overlegen chrezbryzheechno arteriell strips¹⁴,-45 ± 1 mv i rotte middle cerebral arterier ved 60 mmHg lumen trykk¹², og-35 ± 1 mV i rotte parenkymatøs arterier på 40 mmHg lumen trykk¹⁵. Den hviler V_m registrert i unstretched rotte lymfatisk muskel er-48 ± 2 mv¹⁶. V_m av cerebral VSMCs er mer negativ enn i perifere arterier. Til sammenligning, feline midt cerebral arterier ble rapportert å ha en V_m av ca-70 mv, mens chrezbryzheechno og koronar arterier ble rapportert å ha-49 og-58 mv, henholdsvis^17,18. Forskjeller i V_m på tvers av vaskulær senger kan gjenspeile forskjellene i uttrykket og funksjon av ion kanaler og electrogenic natrium-kalium pumper.

Økninger og reduksjoner i V_m er referert til som membran depolarization og hyperpolarization, henholdsvis. Disse endringene i V_m spiller en sentral rolle i mange fysiologiske prosesser, inkludert ion-Channel gating, celle signalering, muskel sammentrekning, og handling potensiell forplantning. På et fast trykk, mange endogene og syntetiske vasodilator forbindelser som aktiverer K⁺ kanaler forårsake membran hyperpolarization, noe som resulterer i vasodilatasjon^1,13. Omvendt, vedvarende membran depolarization er viktig i Agonistiske-indusert eller reseptor-mediert vasokonstriksjon¹⁹. V_m er en kritisk variabel som ikke bare regulerer ca^{2 +} tilstrømningen gjennom VGCC¹³ , men også påvirker utgivelsen av ca^{2 +} fra interne butikker^20,21 og ca^{2 +}-følsomhet for kontraktile apparatet²².

Mens det er flere metoder for å spille inn V_m fra ulike celletyper, synes data innsamlet fra microelectrode impalement metode for kanylert fartøy å være mer fysiologiske enn data innhentet fra isolerte VSMCs. Når innspilt fra isolerte VSMC ved hjelp av gjeldende klemme metoder, V_m er sett på som spontan transient Hyperpolarizations i VSMCs²⁴. Isolerte VSMCs er ikke i syncytium, og endringene i serie motstanden kan bidra til den oscillasjon atferden til V_m. På den annen side, oscillasjon atferd er ikke observert når V_m er registrert fra intakt fartøy, sannsynligvis på grunn av celle-celle kontakt mellom VSMCs som er i syncytium i arterien og er summert hele fartøyet fører til en stabil V_m ²⁴. således er måling av V_m fra trykkbeholdere som bruker standard microelectrode impalement teknikk relativt nær de fysiologiske forholdene.

Innspilling V_m fra kanylert fartøy kunne gi viktig informasjon, siden V_m av VSMCs som er i syncytium er en av de viktigste faktorer som er avgjørende for vaskulær tone og blodstrøm, og modulering av V_m kan gi en måte å dilate eller constrict blodkar. Derfor er det viktig å forstå metodikken involvert i innspillingen V_m. Denne artikkelen beskriver intracellulære innspilling av V_m fra kanylert middels cerebral arterier (MCAs) ved hjelp av en microelectrode impalement metode. Denne protokollen beskriver hvordan du klargjør MCAs, microelectrodes, konfigurerer electrometer og utfører impalement-metoden for å registrere V_m. Også representative data, vanlige problemer som oppstod ved bruk av denne metoden og potensielle problemer, diskuteres.

Protocol

Det mannlig rotter var huset inne det dyr bekymre letter for UMMC, hvilke er anerkjent av foreningen for vurderingen og akkreditering av laboratorium dyr bekymre (AAALAC). Dyr hadde fri tilgang til mat og vann gjennom hele studien. Dyr ble opprettholdt i et kontrollert miljø med temperatur ved 24 ± 2 ° c, luftfuktighet på 60-80% og 12 h lys/mørke sykluser. Alle protokoller ble godkjent av Animal Care og use Committee of UMMC. 1. utarbeidelse av utstyr Plasser en dual Channel dif…

Representative Results

Den presenterte metoden kan være pålitelig brukes til å spille inn Vm i kanylert fartøy. En kort prosedyre som beskriver hvordan du isolerer MCA fra hjernen er presentert i figur 1a. Etter å skille hjernen fra skallen, var MCA dissekert ut og plassert i en Petri parabolen inneholder lav kalsium PSS. En del av bindevev som var festet var også dissekert sammen med MCA bruke våren saks og tang for å hindre skade på MCA under isolasjon. Forsik…

Discussion

Denne artikkelen gir de nødvendige trinnene for hvordan du bruker en skarp microelectrode impalement metode for å spille inn V_m fra en kanylert fartøy forberedelse. Denne metoden er mye brukt, og tilbyr høy kvalitet, konsekvent opptak av V_m som svarer på et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål.

Noen kritiske hensyn og feilsøkingstrinn er beskrevet her for å sikre suksess av metoden. Kvaliteten på microelectrode (dens skarphet og motstand) og mobilnettet pro…

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761