평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수
Summary
전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.
Abstract
현재 연구 관심사의 단백질에 의해 영향을 명확 하 게 확인 된 지형 구조에서 ultrastructural 매개 변수는 정확한 morphometrical 분석에 utero 변환 전송 전자 현미경 (TEM)와 결합 그 바이러스 전송을 통해 유기 체에 도입 되었습니다. 이 결합 된 접근 다음 지형 탐색 지도 조직 아틀라스에서 ultrastructural 식별 macrostructural에서 부드러운 전환에 대 한 수 있습니다. 에-utero-불리고 조직의 고해상도 전자 현미경 계시는 neuropil와 소성 매개 변수, cross-sectioned 시 냅 시스 bouton 지역, 시 냅 스 소포 내 미토 콘 드리 아의 수의 좋은 열 대권 외는 bouton 프로필, 시 냅 스 연락처, cross-sectioned axonal, 수 초 두께, myelin lamellae 수 및 미토 콘 드리 아 프로필의 cross-sectioned 분야의 길이. 이러한 매개 변수의 분석 유전자 구성의 바이러스 성 전송에 의해 영향을 받는 신경 영역에 ultrastructural가 소성의 변화에 대 한 필수적인 통찰력을 보여준다. 이 결합 된 방법만 사용할 수 없는 신경가 소성에 유전자 조작된 생체 약물의 직접 효과 공부 하지만 또한 가능성 (예를 들어, 컨텍스트에서 신경가 소성의 utero 구조 연구 신경 퇴행 성 질병)입니다.
Introduction
아니 광자는 전자의 깊이 학년에서 ultrathin 조직 표본을 침투 수 있습니다. 이 가벼운 현미경 검사 법 기술에 비해 미세 구조의 나노미터 해상도 이미지를 캡처에 가장 귀중 한 장점을 특성. 예를 들어 가장 미토 콘 드리 아, melanosomes, 등 다양 일 분 비과 립, microtubules, microfilaments, 섬 모, microvilli, 및 세포 접합 (세포 표면 세포내 세포의 시각화 수 있습니다. 전문화), 특히 신 경계1,2,,34synapses. 현재 방법론 연구의 전반적인 목표는 utero에서 변환의 가장 최신의 기술을 결합 하 여 태아 간섭에 따라 개발 하는 동안 신경가 소성에 변화의 ultrastructural 인식 이다. 관심의 virally 인코딩된 단백질 중앙 신 경계5,6,7,6척수 포함 하 여에 utero에서 불리고 되어 있다. 예를 들어, 함께 가장 utero에서 변환 사용 되었습니다 L1 및 핵 수용 체 단백질 사이 상호 작용에 관해서는 특히 L1 불충분 한 쥐에서 소성을 학습 하는 모터에 세포 접착 분자 L1의 효과 공부 하 고 소 뇌 신경7에서.
Neuroplasticity 매개 변수 분석 신 경계 내의 작은 지역의 지역화에 대 한 정확한 정보가 필요합니다. 따라서, 그것은 ultrastructural 세부 사항 및 다른 구조에 관하여 그들의 정확한 지형 방향을 설명 하기 위해 적절 한입니다. 현재 연구에서 특정 준비 방법 빛과 전자 현미경 검사 법에 따라 다른 형태학 분야의 상세한 조사에 제공 됩니다. 이 이렇게 결합 조직 조작, 마우스 뇌와 척수의 utero에 변환 시작 하 고 관류 고정, 다음의 몇 가지 기술을 몰드-포함, 그리고 가장에 대 한 처리 하는 조직. 포함 및 가장에 대 한 조직의 처리 사이 포함 하는 필수적인 단계는의 정확한 microphotographic 및 낮은 확대 설명서에 대 한 허용 간섭 빛 반사 기술을 사용 하 여 조직의 설명서 조직 표본8,,910. 현재 접근에 통합,이 기술은 신경 조직 표면 및 가장에 대 한 그들의 준비에 앞서 표본 조각 프로필의 지형 및 구조 정보를 검토 하는 연구를 수 있습니다.
전체 두뇌를 단면에 대 한 특별 한 프레임 stereotaxic 좌표에 해당 합니다. 이 프레임과 신경 조직에서 영역의 형태 3 차원 (3D) 재건 혜택 형태학 분석에 사용할 수 있습니다. 시각화 된 섹션의 macrographs 지형 좌표를 할당 빌드하고를 순차적으로 번호가 매겨진된 섹션 조직 아틀라스에 지도.
수 지 처리, 후 포함 된 조직 ultrathin 섹션으로 구분 됩니다 (< 70 nm) 위에서 언급 한 조직 아틀라스의 지도 따라 선택된 영역을 포함. 그들의 내용의 및 단지 내에 인접 구조에 연락처의 소성 매개 변수 (예: 횡단면 프로필 영역 시 냅 스 boutons 또는 axonal 섬유)의 고해상도 이미지를 얻기 위해 가장 ultrathin 섹션 대상이 됩니다. neuropil입니다.
여기에 설명 된 방법으로 마이크로-그리고 nanostructures 시각화 된 macrostructures에서 부드러운 전환 utero에서 변환 개발의 긴장 후 형태학 신경가 소성의 비교 심층 연구를 허용 시스템입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utero에서 변환의 중요 한 단계는 주입. 정확한 주입 뇌 심 또는 관심의 다른 영역으로 경험 및 실습 기술 필요합니다. 얇은 microcapillary 팁, 덜 조직 손상이 발생할 수 있습니다; 그러나,이 사출 압력을 증가 하는 비용입니다. Utero electroporation19,20,,2122, 달리 utero에서 변환 후 삽입 된 배아의 생존 율은 아?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 지원 및 동물 관리에 대 한 의료 학부, Ruhr 대학 보 훔에 동물 시설의 동료를 감사합니다.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
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