Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Génétique

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas er en kraftfuld teknologi til ingeniør komplekse genomer af planter og dyr. Vi detalje her, en protokol til effektivt redigere det menneskelige genom ved hjælp af forskellige Cas endonucleases. Vi fremhæve vigtige overvejelser og design parametre til at optimere redigering effektivitet.

Abstract

Klyngesystem regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) funktioner naturligt i bakteriel adaptive immunitet, men har været succesfuldt repurposed for genom engineering i mange forskellige levende organismer. Mest almindeligt, vildtype CRISPR forbundet 9 (Cas9) eller Cas12a liv1975 bruges til at kløve specifikke steder i genomet, hvorefter DNA dobbelt-strenget pause er repareret via ikke-homologe slutningen at deltage (NHEJ) vej eller homologi-instrueret reparation ( HDR) pathway afhængigt af om en donor skabelon er fraværende eller præsentere henholdsvis. Til dato, har CRISPR systemer fra forskellige bakteriearter vist sig at være i stand til at udføre genom-redigering i pattedyrsceller. Men trods den tilsyneladende enkelhed af teknologien, flere konstruktionsparametre skal betragtes, som ofte lader brugere forvirret om, hvordan du bedst til at udføre deres genom-redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplet workflow fra eksperimentelle design for identifikation af celle kloner, der bærer ønskede DNA ændringer, med mål at fremme vellykket gennemførelse af genom-redigering eksperimenter i pattedyr cellelinjer. Vi fremhæve vigtige overvejelser for brugerne at tage til efterretning, herunder valg af CRISPR system, spacer længde og udformningen af en enkelt-strenget oligodeoxynucleotide (ssODN) donor skabelon. Vi forestiller os, at denne arbejdsproces vil være nyttig for gen knockout undersøgelser, sygdom modellering indsats, eller generation af reporter cellelinjer.

Introduction

Evnen til at ingeniør genomet af alle levende organisme har mange biomedicinske og bioteknologiske applikationer, såsom korrektion af sygdom-forårsager mutationer, opførelsen af præcise cellulære modeller for sygdom undersøgelser eller generation af landbruget afgrøder med ønskværdige egenskaber. Siden århundredeskiftet, forskellige teknologier er udviklet til genom engineering i pattedyrceller, herunder meganucleases¹^,²^,³, zink finger nukleaser⁴^,⁵, eller transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Men disse tidligere teknologier er enten svært at programmet eller kedelig at samle, dermed hæmmer deres udbredt vedtagelse i forskningen og industrien.

I de seneste år, de klynger interspaced regelmæssigt korte palindromiske gentagelser (CRISPR) – CRISPR-forbundet (Cas) system er opstået som en kraftfulde nye genom engineering technology¹⁰^,¹¹. Oprindeligt en adaptive immunsystem i bakterier, det har været succesfuldt implementeret for genom ændring i planter og dyr, herunder mennesker. Den primære årsag, hvorfor CRISPR-Cas har opnået så stor popularitet på så kort tid er der det element, der bringer de vigtigste Cas endonuklease, såsom Cas9 eller Cas12a (også kendt som Cpf1), til den korrekte placering i genomet er blot et kort stykke af kimære enkelt guide RN A (sgRNA), som er ligetil at design og billigt at syntetisere. Efter at blive rekrutteret til mål-webstedet, Cas enzym fungerer som et par af molekylære sakse og kløver det bundne DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domæner¹²^,¹³^,¹⁴. Den resulterende dobbelt strandede pause (DSB) er efterfølgende repareres af celler via enten ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) eller homologi-instrueret reparation (HDR) pathway. I mangel af en reparation skabelon, er DSB repareret af den fejlbehæftede NHEJ vej, der kan give anledning til pseudo-tilfældige indsættelse eller deletion af nukleotider (indels) på webstedet cut, potentielt forårsager frameshift mutationer i gener, protein-kodning. Men i nærværelse af en donor-skabelon, der indeholder de ønskede DNA ændringer, DSB er repareret af high fidelity HDR pathway. Almindelige typer af donor skabeloner omfatter enkeltstrenget oligonukleotider (ssODNs) og plasmider. Førstnævnte bruges typisk, hvis de påtænkte DNA ændringer er små (f.eks. ændring af en enkelt basepar), mens sidstnævnte er typisk bruges hvis man ønsker at indsætte en relativt lang sekvens (f.eks den kodende sekvens af en grøn fluorescerende proteiner eller Normal god landbrugspraksis) i target locus.

Liv1975 aktivitet af Cas protein kræver tilstedeværelsen af et protospacer tilstødende motiv (PAM) på målet site¹⁵. PAM Cas9 er ultimo 3′ protospacer, mens PAM Cas12a (også kaldet Cpf1) er på 5′-enden i stedet¹⁶. Cas-guide RNA komplekse er ude af stand til at indføre en DSB, hvis PAM er fraværende¹⁷. Derfor, PAM placerer en begrænsning på de genomisk steder hvor en særlig Cas nukleasen er stand til at kløve. Heldigvis, Cas nukleaser fra forskellige bakteriearter typisk udviser forskellige PAM krav. Derfor, ved at integrere forskellige CRISPR-Cas systemer i vores engineering værktøjskasse, kan vi udvide antallet af websteder, der kan være målrettet i en genom. Desuden kan en naturlig Cas enzym manipuleret eller udviklet sig til at genkende alternative PAM sekvenser, yderligere udvide anvendelsesområdet for genomisk mål tilgængelige for manipulation¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Selv om flere CRISPR-Cas systemer er tilgængelige for genom engineering formål, har de fleste brugere af teknologien påberåbt sig hovedsageligt Cas9 nukleasen fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) af flere årsager. Først, det kræver en forholdsvis simpelthen NGG PAM i modsætning til mange andre Cas proteiner, der kan kun kløver i overværelse af mere komplekse PAMs. For det andet, det er den første Cas liv1975 implementeres med succes i humane celler²¹^,²²^,²³^,²⁴. For det tredje er SpCas9 langt de bedst karakteriserede enzym til dato. Hvis en forsker ønsker at bruge en anden Cas nukleasen, vil han eller hun ofte være uklart, om hvordan man bedst at designe eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil udføre i forskellige biologiske sammenhænge i forhold til SpCas9.

For at skabe klarhed for den relative resultater af forskellige CRISPR-Cas systemer, har vi for nylig udført en systematisk sammenligning af fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a), og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)²⁵. Vi vurderet til en fair sammenligning, de forskellige Cas nukleaser bruger det samme sæt af målwebsteder og andre forsøgsbetingelser. Undersøgelsen også afgrænset design parametre for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig reference for brugere af teknologien. Her, for bedre at kunne sætte forskerne til at gøre brug af CRISPR-Cas-system, vi leverer en trinvis protokol for optimal genom engineering med forskellige Cas9 og Cas12a enzymer (Se figur 1). Protokollen ikke kun omfatter eksperimentelle detaljer men også vigtige Designovervejelser at maksimere sandsynligheden for en vellykket genom engineering resultatet i pattedyrsceller.

Figur 1 : En oversigt over arbejdsproces til at generere genom redigeret menneskelige cellelinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. design af sgRNAs Vælg et passende CRISPR-Cas-system. Først inspicere målområde for PAM sekvenser af alle Cas9 og Cas12a nukleaser, der har vist sig at være funktionelle i pattedyrceller16,21-32. Fem hyppigt anvendte enzymer er givet i tabel 1 sammen med deres respektive PAMs.Bemærk: Udover endonucleases anført i tabel 1, der er andre mindre almindeligt anvendte Cas enzymer, der har været med succes indsat i pattedyrceller samt, såsom en Cas9 n…

Representative Results

Til at udføre en genom-redigering eksperiment, en CRISPR plasmid udtrykker en sgRNA målretning locus af interesse skal klones. Først, plasmidet er fordøjet med en restriktion enzym (typisk en type IIs enzym) til at linearize det. Det anbefales at løse fordøjet produktet på en 1%-agarosegel sammen med en ufordøjet plasmid at skelne mellem en fuldstændig og delvis fordøjelsen. Som ufordøjet plasmider er supercoiled, de har tendens til at køre hurtigere end deres lineariseret modparter (Se f…

Discussion

CRISPR-Cas-system er en kraftfuld, revolutionerende teknologi til ingeniør genomer og transcriptomes af planter og dyr. Talrige bakteriearter har vist sig for at indeholde CRISPR-Cas systemer, som potentielt kan være tilpasset til genom og transkriptom engineering formål⁴⁴. Selv om Cas9 liv1975 fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det første enzym til implementeres med succes i humane celler²¹^,²²^,<sup class="xref…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. understøttes af et agentur for videnskab teknologi og forsknings fælles Rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council tildele (OFIRG/0017/2016), Grundforskningsfond tilskud (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Ministeriet for uddannelse Tier 1 tilskud (RG50/17 (S)), en start indrømmer Nanyang Technological University og midler for den internationale genetisk Engineering maskine (iGEM) konkurrence fra Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

References

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Génétique. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).