चूहों में वेलोलर मैक्रोफेज फैगोसाइटोसिस और बैक्टीरिया निकासी
Summary
यहाँ हम सामान्य तरीकों की रिपोर्ट करते हैं, जो फेफड़ों से मूरीन अल्वओलर मैक्रोफेज और बैक्टीरियल क्लीयरेंस के फेगोसाइटिक फंक्शन का विश्लेषण करते हैं । इन पद्धतियों में फ्लोरेसेइन आइसोथियोसाइनेट मोतियों के विट्रो भगोसायटोसिस में और स्यूडोंमोनास एरुगिनोसा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के vivo फेगोसाइटोसिस में अध्ययन करते हैं । हम भी चूहों में पी एरुगिनोसा समाशोधन के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
वायुकोशीय मैक्रोफेज (एंस) फेफड़ों की वायुकोशीय अंतरिक्ष गार्ड । एंस द्वारा फैगोसाइटोसिस हमलावर रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मृत कोशिकाओं या विदेशी कणों को हटाने, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और ऊतक remodeling के संकल्प में, प्रक्रियाओं है कि विभिन्न सतह रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं एम्स । यहां, हम एंस के भक्षकाण्विक समारोह के विश्लेषण के लिए तरीकों की रिपोर्ट में विट्रो में और vivo assays और प्रयोगात्मक रणनीतियों पैटर्न मांयता रिसेप्टर के बीच अंतर करने के लिए-, रिसेप्टर पूरक-, और एफसी गामा रिसेप्टर-mediated phagocytosis. अंत में, हम एक विधि पर चर्चा करने के लिए स्थापित करने और एक पी एरुगिनोसा निमोनिया मॉडल की विशेषता चूहों में विवो में बैक्टीरिया की निकासी का आकलन करने के लिए । ये assays AM कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए सबसे आम तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं और अन्य अंगों में मैक्रोफेज समारोह और बैक्टीरियल निकासी का अध्ययन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
एंस आराम चरण में एल्वियोली में प्रमुख निवासी फ़ैगोसाइट और मांयता और सांस रोगजनकों और विदेशी कणों1,2के internalization के माध्यम से जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रमुख खिलाड़ियों में से एक हैं । यह बताया गया है कि एम्स में कई फुफ्फुसीय रोगजनकों की तेजी से निकासी के लिए जरूरी हैं जैसे कि पी. एरुगिनोसा और क्लेबसिएला निमोनिया3,4, इसलिए एएम फैगोसाइटोसिस में एक कमी अक्सर श्वसन में परिणाम संक्रमण, जैसे तीव्र निमोनिया, जो उच्च मृत्यु दर और रुग्णता दरों का कारण है ।
एंस भी साइटोकिन्स और ऐसे tnf-α और आईएल-1β, जो वायुकोशीय पर्यावरण की अंय कोशिकाओं के साथ crosstalk के रूप में chemokines उत्पादन और भड़काऊ न्यूट्रोफिल, monocytes भर्ती द्वारा फेफड़ों में जन्मजात भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ, और फेफड़ों में अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं5. उदाहरण के लिए, आईएल-1β एंस द्वारा उत्पादित उपकला कोशिकाओं6से न्युट्रोफिल chemokine CXCL8 की रिहाई के लिए प्रधानमंत्री मदद करता है । इसके अलावा, एम्स एपोप्टोटिक पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स (pmns) के फैगोसाइटोसिस में योगदान देता है, जिसमें विफलता से आसपास के ऊतकों में pmns से इंट्राकोशिलर एंजाइम की निरंतर रिसाव होता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक क्षति और लंबे समय तक सूजन होती है । 7 , 8 , 9.
एंस द्वारा फैगोसाइटोसिस को एम्स के पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (prrs) द्वारा रोगजनक सतह पर रोगज़नक़-संबद्ध आणविक पैटर्न की प्रत्यक्ष मान्यता के द्वारा मध्यस्थता की जाती है या एम्स के प्रतिरक्षा effector रिसेप्टर्स के साथ opsonized रोगजनकों के बंधन द्वारा 10. उत्तरार्द्ध के लिए, एम्स उनके fcγ रिसेप्टर्स (fcγr) या उनके पूरक रिसेप्टर्स (सीआर)11के माध्यम से पूरक टुकड़े, C3b और C3bi के साथ लेपित रोगजनकों के माध्यम से इम्युनोग्लोबुलिन (igg) के साथ opsonized लक्ष्यों को पहचान सकते हैं । पूरक रिसेप्टर्स के बीच, इम्यूनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली के सीआर (crig) चुनिंदा ऊतक मैक्रोफेज12में व्यक्त किया जाता है, और हाल ही में एक खोज पी के संदर्भ में phagocytosis में crig की भूमिका पर प्रकाश डाला. एरुगिइनोसा निमोनिया 13.
कई मूल अध्ययनों से मैक्रोफेज समारोह के आणविक तंत्र का वर्णन करने के लिए बृहदभक्षी फैगोसाइटोसिस का मूल्यांकन करने के तरीकों का उपयोग करें14,15. हालांकि, वीवो फेगोसाइटोसिस में तरीकों को फैगोसाइटोसिस के सटीक प्रमाणन की आवश्यकता होती है । यहां, हम दोनों के लिए एक विस्तृत पद्धति संक्षेप में विट्रो में और vivo phagocytosis में फ्लोरेसेइन आइसोथियोसायनेट (fitc) का उपयोग-कांच के मोती और पी एरुगिनोसा ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp), क्रमशः. इसके अलावा, हम prr-, CR-, और fcγr-मध्यस्थता phagocytosis के बीच अंतर करने की विधि की व्याख्या । अंत में, हम पी एरुगिनोसा निमोनिया के संबंध में माउस में बैक्टीरियल निकासी की विशेषता के लिए एक विधि की रिपोर्ट ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक गैस विनिमय समारोह प्रदर्शन करते समय, फेफड़ों लगातार विदेशी कणों, रोगजनकों, और एलर्जी का सामना । AMs उनके मुख्य समारोह के आधार पर रक्षा की पहली पंक्ति, अर्थात् phagocytosis प्रदान करते हैं । एंस भी रोगजनकों को न?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य करने के लिए X. zhao R01HL116826 अनुदान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
