Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van de pathofysiologie van proliferatieve diabetische retinopathie met behulp van patiënt-afgeleide, operatief verwijderd, fibrovascular weefsels voor driedimensionale inheemse karakterisering en ex vivo weefselkweek. Dit ex vivo cultuur model is ook vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.
Diabetische retinopathie (DR) is de meest voorkomende microvasculaire complicaties van diabetes en een van de belangrijkste oorzaken van blindheid in de werkende leeftijd volwassenen. Geen huidige dierlijke modellen van diabetes en retinopathie zuurstof-geïnduceerde ontwikkelen de full-range progressieve wijzigingen manifesteert zich in menselijke proliferatieve diabetische retinopathie (PDR). Daarom heeft inzicht in de pathogenese van de ziekte en pathofysiologie vertrouwd grotendeels op het gebruik van histologische secties en glasvocht monsters in benaderingen die alleen steady-state informatie te over de betrokken pathogene factoren verstrekken. Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat dynamische cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) interacties in het kader van driedimensionale (3D) microenvironments essentieel voor de mechanistische en functionele studies naar de ontwikkeling van nieuwe zijn behandelingsstrategieën. Dus veronderstelde we dat het pathologische fibrovascular weefsel chirurgisch verwijderd uit ogen met PDR betrouwbaar ontrafelen de cellulaire en moleculaire mechanismen van deze verwoestende ziekte en het potentieel voor roman klinische testen kan worden gebruikt interventies. Voor dit doel ontwikkeld wij een nieuwe methode voor 3D ex vivo cultuur van chirurgisch weggesneden patiënt afkomstige fibrovascular weefsel (FT), dat als een relevante model van menselijke PDR pathofysiologie dienen zal. De FTs worden ontleed in explantaten en ingebed in fibrine matrix voor ex vivo cultuur- en 3D-karakterisering. Geheel-mount immunofluorescentie van de inheemse FTs en eindpunt culturen kunt grondig onderzoek van weefsel samenstelling en meercellige processen, wijzen op het belang van 3D weefsel-niveau karakterisering blootleggen relevante kenmerken van PDR pathofysiologie. Dit model zal toelaten de gelijktijdige evaluatie van moleculaire mechanismen, mobiele/weefsel processen en reacties van de behandeling in de complexe context van dynamische biochemische en fysische interacties binnen de PDR weefsel architectuur en communicatie. Aangezien dit model PDR pathofysiologie recapituleert, zal het ook zijn vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.
DR is een ernstige oogbeschadigingen en/of complicatie van diabetes, een ziekte die enorme proporties in de afgelopen drie decennia1heeft bereikt. Twintig jaar na de diagnose, vrijwel elke patiënt met type 1 diabetes en 60% van de patiënten met type 2 diabetes aanwezig tekenen van retinopathie, waardoor diabetes per se een van de belangrijkste oorzaken van blindheid in de leeftijd volwassenen2werken. Volgens het niveau van de microvasculaire degeneratie en ischemische schade, wordt DR ingedeeld in de niet-proliferatieve DR (niet-PDR) en proliferatieve DR (PDR). De einde-fase ziekte, PDR, wordt gekenmerkt door ischemie – en ontsteking-geïnduceerde neovascularization en fibrotische reacties op de vitreoretinal-interface. In onbehandelde voorwaarden, zullen deze processen leiden tot blindheid als gevolg van glasvocht bloeding, retinale fibrose, tractional retinale detachement en neovascular glaucoom3,4. Ondanks de recente vooruitgang target huidige behandelingsopties alleen DR stadia, met inbegrip van diabetische macula oedeem en PDR, wanneer retinale schade heeft reeds volgde. Bovendien is een groot deel van de patiënten van de DR is niet gebaat bij de huidige behandeling arsenaal, met vermelding van een dringende behoefte aan verbeterde therapieën4,5,6.
Meerdere andere ikn vivo ziekte/ontwikkelingstoxiciteit en diabetische dierlijke modellen hebben ontwikkeld tot nu toe, maar geen van hen recapituleert de volledige reeks van pathologische functies waargenomen in menselijke PDR7,8. Bovendien geeft een groeiende hoeveelheid bewijs dat behandeling reacties strak met de ECM-samenstelling, alsmede de ruimtelijke rangschikking en de interactie tussen de cellulaire en Acellulair communicatie-9 verbonden bent. Daarom zetten we, uit een klinisch relevante model van menselijke PDR ontwikkelen door gebruik te maken van de FT pathologisch materiaal dat gewoonlijk uit ogen Vitrectomie ondergaan als onderdeel van het chirurgische beheer van PDR10is weggesneden.
Dit manuscript beschrijft het protocol voor de 3D ex vivo cultuur en karakterisering van de chirurgisch-weggesneden, PDR patiënt afkomstige pathologische FT. De hier beschreven methode is gebruikt in een recente publicatie die bewezen succesvolle deconstructie van de native 3D PDR weefsel landschap en recapitulatie van kenmerken van PDR pathofysiologie, met inbegrip van angiogenic en fibrotische reacties van de abnormale vasculaire structuren11. Dit model bleek ook nieuwe functies die niet kunnen gemakkelijk worden gewaardeerd uit dunne histologische secties, zoals ruimtelijk beperkt apoptosis, evenals proliferatie en vasculaire islet formatie11. Glasvocht vloeistof is met succes gebruikt door anderen op 3D endothelial sferoïde culturen om te evalueren van de potentiële angiogenic en de werkzaamheid van angiostatic moleculen12. Wanneer gecombineerd met een in vitro 3D lymfatische endothelial cel (LEC) sferoïde kiemen assay PDR glasvocht als stimulerende middelen gebruiken, bleek ons model dat de bijdrage van beide oplosbare vitreal factoren evenals als lokale signalen binnen het neovascular weefsel aan als nog slecht begrepen LEC deelname PDR pathofysiologie3,11. In het beheer van de PDR is vitreoretinal chirurgie een routinematig uitgevoerd maar uitdagende procedure. Zoals chirurgische Instrumentation en technieken continue verbetering en verfijning zien, tijdige en conservatieve verwijdering van fibrovascular proliferatieve specimen niet alleen verbetert visie uitkomst, maar biedt ook waardevolle weefsel materiaal voor de onderzoek naar de pathofysiologie en behandeling reacties PDR in de complexe translationeel aspecten van de communicatie van levende menselijke weefsels.
Gezien het belang van relevante weefsel communicatie voor betrouwbare functionele cel- en moleculaire mechanistische resultaten is het noodzakelijk om te vinden van de juiste experimentele modellen waarmee deze weefsel omgeving. De hierin beschreven ex vivo PDR cultuur model voor de FTs fibrine-embedded kan het onderzoek van de mechanismen van de PDR pathofysiologie in het kader van het inheemse, complexe en meercellige van de PDR klinische monsters.
Kritische stappen in het protocol …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn heel dankbaar dat hij de medische en chirurgische netvlies collega’s, de verpleegkundigen en de hele staf van de diabetische eenheid en Vitreoretinal chirurgie eenheid op het departement van oogheelkunde, Helsinki University Hospital voor actief deelnemen aan de aanwerving van patiënten. Wij danken Biomedicum Molecular Imaging eenheid voor imaging faciliteiten. Wij danken Anastasiya Chernenko voor uitstekende technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Academie van Finland (KL), Universiteit van Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Fins kanker instituut (KL), Karolinska Institutet (KL), Finse Eye Foundation (SL), Eye en Weefsel Bank Foundation (SL), Mary en Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) en HUCH klinische Research Grants (TYH2018127 na TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG), alsmede het doctoraatsprogramma in biogeneeskunde (EG).
Material | |||
Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth factors | |||
Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary antibodies | |||
CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary antibodies | |||
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |