Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante
Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’étudier la physiopathologie de la rétinopathie diabétique proliférante en utilisant les tissus dérivés de patient, excisées chirurgicalement, fibrovasculaire pour tridimensionnelle native caractérisation et ex vivo vitroplants. Cela ex vivo modèle de culture est également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.
Abstract
Rétinopathie diabétique (RD) est la complication la plus fréquente microvasculaire du diabète et une des principales causes de cécité chez les adultes en âge de travailler. Aucun cours modèles animaux de diabète et de la rétinopathie induite par l’oxygène ne développent les gamme complète des changements progressifs manifestées dans la rétinopathie diabétique proliférative humaine (PDR). Par conséquent, la compréhension de la pathogenèse de la maladie et la physiopathologie s’est appuyé en grande partie sur l’utilisation de coupes histologiques et vitreux échantillons dans les approches qui seulement stationnaire renseignent sur les facteurs pathogènes impliqués. Augmentant la preuve indique que les cellules dynamiques et interactions cellule-extracellulaire (ECM) dans le cadre des trois dimensions (3D) micro-environnements sont essentielles pour les études mécanistiques et fonctionnels vers le développement de nouveau stratégies de traitement. Par conséquent, nous avons supposé que le tissu fibrovasculaire pathologique excisé chirurgicalement des yeux avec les PDR pourrait servir à démêler avec fiabilité les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette maladie dévastatrice et de tester le potentiel de roman clinique interventions. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode pour la 3D ex vivo culture d’excisées chirurgicalement dérivé de patient fibrovasculaire tissulaire (FT), qui servira comme un modèle pertinent de physiopathologie humaine de PDR. Les FTs sont disséqués dans les explants et incorporées dans la matrice de fibrine pour ex vivo characterization de culture et de la 3D. Immunofluorescence entier-montent des FTs natives et des cultures de point final permet une enquête approfondie de la composition du tissu et des processus multicellulaires, soulignant l’importance de la caractérisation au niveau du tissu 3D pour découvrir les caractéristiques pertinentes des Physiopathologie de la RDP. Ce modèle permettra l’évaluation simultanée des mécanismes moléculaires, les processus cellulaire/tissulaire et les réactions aux traitements dans le cadre complex des interactions biochimiques et physiques dynamiques au sein de l’architecture de tissu PDR et le microenvironnement. Étant donné que ce modèle reprend la physiopathologie de la RDP, il sera également prête pour tester ou développer de nouveaux traitements.
Introduction
DR est une complication oculaire grave de diabète, une maladie qui a atteint des proportions énormes dans les dernières trois décennies1. Vingt ans après que le diagnostic, pratiquement tous les patients atteints de diabète de type 1 et 60 % des patients avec type 2 diabète présente des signes de rétinopathie, rendant le diabète en soi l’un des principaux causes de cécité dans le travail des adultes d’âge2. Selon le degré de dégénérescence microvasculaire et dommages ischémiques, DR est classé dans non-Proliférante (non-PDR) et DR proliférative (PDR). La maladie terminale, Lao, se caractérise par une néovascularisation induite par l’ischémie et l’inflammation et réponses fibreux à l’interface vitréo-rétinienne. Dans des conditions non traitées, ces processus conduira à la cécité due à l’hémorragie vitréenne, rétinienne fibrose, décollement de rétine Tractionnel et néovasculaire glaucome3,4. Malgré des progrès récents, les options thérapeutiques actuelles ciblent uniquement DR stades, y compris le œdème maculaire diabétique et PDR, lorsque les dommages rétiniens a déjà s’ensuivit. En outre, une grande proportion des patients du DR ne bénéficie pas actuel arsenal thérapeutique, ce qui indique un besoin urgent de traitements améliorés4,5,6.
Plusieurs autres jen vivo maladie/développement modèles et modèles animaux diabétiques ont été développés à ce jour, mais aucun d’eux ne récapitule l’ensemble des caractéristiques pathologiques observées dans humain RDP7,8. En outre, augmentant la preuve indique que les réactions aux traitements sont correctement raccordées à la composition de l’ECM ainsi que l’arrangement spatial et l’interaction entre le microenvironnement cellulaire et acellulaire9. Nous avons, par conséquent, entrepris d’élaborer un modèle cliniquement pertinent de RDP humain en utilisant le matériel pathologique FT qui est communément excisé d’yeux subissant la vitrectomie dans le cadre de la prise en charge chirurgicale des PDR10.
Ce manuscrit a décrit le protocole pour la 3D ex vivo culture et caractérisation de la chirurgicalement-excisés, PDR patient-dérivés FT pathologique. La méthode décrite ici a été utilisée dans une publication récente qui a démontré le succès déconstruction du paysage tissu PDR 3D native et récapitulation des éléments de physiopathologie PDR y compris angiogénique et réponses fibreuses de l’anormal 11de structures vasculaires. Ce modèle a également révélé caractéristiques nouvelles qui ne peuvent pas être facilement appréciés de fines coupes histologiques, tels que dans l’espace confiné l’apoptose et la prolifération comme îlot vasculaire formation11. Fluide vitreux a été utilisé avec succès par d’autres sur les cultures de sphéroïde endothéliales 3D pour évaluer son potentiel angiogénique et l’efficacité des molécules d’angiostatique12. Lorsqu’il est combiné avec un sphéroïde 3D cellules endothéliales lymphatiques (LEC) in vitro test à l’aide de corps vitré PDR comme stimulant la germination, notre modèle a révélé que la contribution de ces deux Vitréennes soluble des facteurs aussi bien en tant que locales repères dans le tissu néovasculaire à la comme encore mal compris ESL participation aux PDR physiopathologie3,11. Dans la gestion de RDP, chirurgie vitréo-rétinienne est une procédure régulièrement effectuée pourtant difficile. Comme techniques et instrumentations chirurgicales voient avancement continu et sophistication, opportune et prudente enlèvement de spécimen proliférative fibrovasculaire non seulement améliore l’issue de la vision, mais renferme aussi des documents de tissus précieux pour le enquête de PDR pathophysiologie et traitement réponses chez les aspects complexes et translationnelles du microenvironnement des tissus humains vivants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compte tenu de l’importance du microenvironnement tissu pertinentes pour cellule fonctionnelle fiable et résultats de mécaniques moléculaires, il est impératif de trouver des modèles expérimentaux appropriés qui fournissent cet environnement tissulaire. Le modèle ci-après décrit ex vivo PDR culture pour les FTs fibrine incorporé permet l’investigation des mécanismes de la physiopathologie de la RDP dans le contexte autochtone, complex et multicellulaire des échantillons cliniques PDR.
<p cla…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants aux collègues de rétine médicale et chirurgicale, infirmières et tout le personnel de l’unité diabétique et l’unité de chirurgie vitréo-rétinienne dans le département d’ophtalmologie, hôpital universitaire de Helsinki pour participer activement au recrutement des patients. Nous remercions Biomedicum unité d’imagerie moléculaire pour les installations d’imagerie. Nous remercions Anastasiya Chernenko excellente assistance technique. Cette étude a été financée par des subventions de l’Académie de Finlande (KL), Université d’Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Institut finlandais de Cancer (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandais Eye Foundation (SL), œil et Banque de tissus Foundation (SL), Mary et Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) et subventions de recherche clinique HUCH (TYH2018127 après TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) ainsi que le Programme Doctoral en biomédecine (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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