Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish
Summary
We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak – en grot-woning vormen.
Abstract
Grot dieren vormen een dwingende systeem voor onderzoek naar de evolutionaire mechanismen en genetische basis ten grondslag liggen aan veranderingen in talrijke complexe eigenschappen, met inbegrip van oog degeneratie, albinisme slaap verlies, hyperphagia en zintuiglijke verwerking. Soorten cavefish van over de hele wereld weergeven een convergente evolutie van morfologische en gedrags eigenschappen als gevolg van gedeelde belasting van het milieu tussen verschillende grot systemen Divers grot soorten hebben onderzocht in het laboratorium-omgeving. De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus, met slechtzienden en blinden vormen, heeft unieke inzicht in biologische en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen en is goed klaar als een opkomende modelsysteem. Terwijl in A. mexicanus kandidaat-genen regulering van de evolutie van de verschillende biologische processen zijn vastgesteld, is de mogelijkheid voor het valideren van een rol voor afzonderlijke genen beperkt gebleven. De toepassingvan Transgenese en bewerken van gen technologie heeft het potentieel om te overwinnen deze aanzienlijke belemmering en te onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van complexe eigenschappen. Hier beschrijven we een andere methode voor het manipuleren van genexpressie in A. mexicanus. Benaderingen omvatten het gebruik van morpholinos, Tol2 Transgenese, en gen-editing systemen, gebruikte in zebrafish en andere vissen huizen modellen, te manipuleren van de genfunctie in A. mexicanus. Deze protocollen bevatten gedetailleerde beschrijvingen van getimede fokken procedures, de collectie van bevruchte eieren, injecties en de selectie van genetisch gemodificeerde dieren. Voor het onderzoek naar de genetische en neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de evolutie van de diverse eigenschappen in A. mexicanustoestaat deze methodologische benaderingen.
Introduction
Sinds Darwins Origin of Species1, hebben de wetenschappers diepgaande inzichten in hoe eigenschappen evolutionair worden gevormd in reactie op bepaalde milieu- en ecologische druk, dankzij grot organismen2opgedaan. De Mexicaanse tetra, A. mexicanus, bestaat uit eyed voorouderlijke ‘oppervlak’ populaties die bewonen rivieren in Mexico en Zuid-Texas en van ten minste 29 geografisch geïsoleerde populaties van afgeleide grot morphs bevolken de Sierra del Abra en andere gebieden van Noordoost Mexico3. Een aantal grot-geassocieerde kenmerken zijn geïdentificeerd in A. mexicanus, waaronder veranderde zuurstofverbruik depigmentatie, verlies van ogen en voeding en gedrag4,5,6, foerageren veranderd 7,8,9. A. mexicanus presenteert een krachtig model voor het onderzoek naar mechanismen van convergente evolutie als gevolg van een welomschreven evolutionaire geschiedenis, een gedetailleerde karakterisering van de ecologische omgeving en de aanwezigheid van onafhankelijk geëvolueerd grot populaties10,11. Veel van de grot-afgeleide eigenschappen die aanwezig zijn in cavefish, met inbegrip van verlies van het oog verlies slapen, verhoogde voederen, verlies van scholing, agressie, verminderd en verminderd stress reacties, geëvolueerd zijn meerdere malen door onafhankelijke oorsprong, vaak met behulp van verschillende genetische routes tussen grotten8,12,13,14,15. Dit herhaald evolution is een krachtige aspect van het systeem van A. mexicanus en bieden inzicht in de meer algemene kwestie van hoe genetische systemen voor het genereren van soortgelijke fenotypen kan worden verstoord.
Terwijl de toepassing van genetische technologie voor het mechanistisch onderzoek van de genfunctie heeft is beperkt in vele vissoorten (met inbegrip van A. mexicanus), vormen recente vooruitgang in de zebravis een basis voor de ontwikkeling van de genetische technologie in vis 16,17,18,19,20. Tal van hulpmiddelen worden veel gebruikt in zebrafish te manipuleren van genexpressie en de uitvoering van deze procedures lang zijn gestandaardiseerd. Bijvoorbeeld, de injectie van morfolino oligos (MOs) stadium de eencellige selectief blokkeert RNA en voorkomt de vertaling voor een korte tijd venster tijdens ontwikkeling21,22. Bovendien, bewerken van gene benaderingen, zoals geclusterd regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) interspaced / CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) en transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN), toestaan voor de generatie van gedefinieerde verwijderingen of, in sommige gevallen, invoegingen door middel van een recombinatie in genomes19,,20,,23,24. Transgenese wordt gebruikt voor het manipuleren van stabiele genexpressie of functie in een celtype specifieke wijze. Het Tol2 systeem effectief wordt gebruikt voor het genereren van transgene dieren door coinjecting transposase mRNA met een Tol2 DNA plasmide met een transgenic25,26. Het Tol2 -systeem maakt gebruik van de Tol2 transposase van medaka voor het genereren van stabiele germline inlassingen uit transgene construct17. Genereren van Tol2 transgenics houdt een plasmide met een transgenic geflankeerd door Tol2 integratie sites en mRNA voor Tol2 transposase17coinjecting. Dit systeem is gebruikt voor het genereren van een matrix van transgene lijnen in de zebravis en het gebruik ervan heeft onlangs uitgebreid tot extra opkomende modelsystemen, waaronder cichliden killifish, de stekelbaars, en, meer recentelijk, de Mexicaanse cavefish27, 28,29,30.
Terwijl de cavefish een fascinerende biologische systeem voor informatief mechanismen van trait evolutie is, heeft zijn volledige vermogen als een evolutionaire model niet zijn volledig benut. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een onvermogen om te manipuleren genetische en cellulaire functie direct31. Kandidaat-genen regulering van complexe eigenschappen zijn geïdentificeerd met behulp van kwantitatieve trait loci (QTL) studies, maar de validatie van deze kandidaat-genen is moeilijk32,33,34. Onlangs, voorbijgaande knockdown met behulp van morpholinos, gene bewerken met behulp van systemen voor CRISPR en TALEN en het gebruik van Tol2-gemedieerde Transgenese zijn gebruikt voor het onderzoeken van de genetische basis ten grondslag liggen aan een aantal eigenschappen35,36,37 ,38. De uitvoering en de standaardisatie van deze technieken zal toestaan voor manipulaties die ondervragen van de moleculaire en neurale basis van biologische eigenschappen, met inbegrip van de manipulatie van de genfunctie, de etikettering van gedefinieerde cel populaties, en de expressie van functionele verslaggevers. Overwegende dat de succesvolle tenuitvoerlegging van deze genetische hulpprogramma’s voor het manipuleren van genen of cellulaire functie is aangetoond in opkomende modelsystemen, zijn gedetailleerde protocollen nog steeds ontbreekt in A. mexicanus.
A. mexicanus kritisch inzicht geven in de mechanismen van de evolutie in antwoord op een veranderende omgeving en presenteren van de mogelijkheid om nieuwe genen regulering van diverse eigenschappen te identificeren. Een aantal factoren suggereren dat A. mexicanus een uiterst hanteerbare model is voor de toepassing van gevestigde genomic instrumentarium momenteel in gevestigde genetische modellen, inclusief de mogelijkheid om de vis in de laboratoria, groot brood formaat, gemakkelijk te onderhouden transparantie, een gesequenceerd genoom en gedefinieerde gedrags assays39. Hier beschrijven we een methodologie voor het gebruik van morpholinos, Transgenese en gene bewerken in oppervlakte en grot populaties van A. mexicanus. De bredere toepassing van deze instrumenten in A. mexicanus zal zorgen voor een mechanistisch onderzoek naar de moleculaire processen die ten grondslag liggen aan de evolutie van ontwikkelingsstoornissen, fysiologische en gedragsmatige verschillen tussen cavefish en oppervlakte vissen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, verstrekt wij een methodologie voor het manipuleren van de genfunctie met morpholinos, CRISPR/Cas9 gene bewerken en Transgenese methodologie. De rijkdom van de genetische technologie en het optimaliseren van deze systemen in zebrafish zal waarschijnlijk zorgen voor de overdracht van deze tools in A. mexicanus met gemak52. Recente bevindingen hebben gebruikt deze benaderingen in A. mexicanus, maar ze blijven onderbenutte in het onderzoek van verschillende morfologische, ontw…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Sunishka Thakur voor haar hulp bij genotypering en beeldvorming van de oca2 mutant vis afgebeeld in Figuur 2. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) award 1656574 naar A.C.K., NSF award, 1754321, J.K. en A.C.K. en National Institutes of Health (NIH) award R21NS105071 A.C.K. en E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Biologie du développement. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Génétique. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Biologie du développement. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Biologie du développement. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Biologie du développement. , (2018).
