मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर
Summary
हम विकासवादी मॉडल प्रणाली Astyanax mexicanusमें जीन के हेरफेर के लिए दृष्टिकोण का वर्णन । तीन विभिंन तकनीकों का वर्णन कर रहे हैं: Tol2-mediated transgenesis, जीनोम के लक्षित हेरफेर CRISPR का उपयोग कर/ इन उपकरणों से सतह और गुफा में रहने वाले रूपों के बीच अंतर के अंतर्निहित जीन की प्रत्यक्ष जांच की सुविधा होनी चाहिए ।
Abstract
गुफा जानवरों के विकासवादी तंत्र और आनुवंशिकी आंख अध: पतन, albinism, नींद की कमी, hyperphagia, और संवेदी प्रसंस्करण सहित कई जटिल लक्षण में परिवर्तन अंतर्निहित अड्डों की जांच के लिए एक संमोहक प्रणाली प्रदान करते हैं । दुनिया भर से cavefish की प्रजातियों रूपात्मक और व्यवहार अलग गुफा प्रणालियों के बीच साझा पर्यावरण के दबाव के कारण लक्षण के अभिसरण विकास प्रदर्शित करते हैं । प्रयोगशाला की स्थापना में विविध गुफा प्रजातियों का अध्ययन किया गया है । देखा और अंधा रूपों के साथ मैक्सिकन टेट्रा, Astyanax mexicanus, जैविक और आणविक जटिल लक्षण के विकास अंतर्निहित प्रक्रियाओं में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है और अच्छी तरह से एक उभरते मॉडल प्रणाली के रूप में तैयार है । हालांकि विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के विकास को विनियमित करने वाले उम्मीदवार जीन की पहचान मेक्सिकैनस में की गई है, लेकिन व्यक्तिगत जीन के लिए एक भूमिका को मान्य करने की क्षमता सीमित कर दी गई है । Transgenesis और जीन संपादन प्रौद्योगिकी के आवेदन के लिए इस महत्वपूर्ण बाधा को दूर करने और जटिल लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने की क्षमता है । यहां, हम एक. mexicanusमें जीन अभिव्यक्ति हेरफेर के लिए एक अलग पद्धति का वर्णन । दृष्टिकोण morpholinos का उपयोग, Tol2 transgenesis, और जीन संपादन प्रणाली, सामांयतः zebrafish और अंय मछली के मॉडल में इस्तेमाल किया, एक. mexicanusमें जीन समारोह में हेरफेर शामिल हैं । इन प्रोटोकॉल समय पर प्रजनन प्रक्रियाओं के विस्तृत विवरण शामिल हैं, निषेचित अंडे का संग्रह, इंजेक्शन, और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के चयन । इन methodological दृष्टिकोण आनुवंशिक और तंत्रिका एक. mexicanusमें विविध लक्षण के विकास के अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए अनुमति देगा ।
Introduction
1 प्रजातियों के डार्विन मूलके बाद से, वैज्ञानिकों में गहन अंतर्दृष्टि प्राप्त की है कि कैसे लक्षण विकास परिभाषित पर्यावरण और पारिस्थितिक दबाव, गुफा जीवों2के लिए धंयवाद के रूप में आकार रहे हैं । मैक्सिकन tetra, ए mexicanus, है ‘ पैतृक ‘ सतह आबादी है कि मेक्सिको और दक्षिणी टेक्सास भर में नदियों निवास और कम से दूर 29 व्युत्पंन गुफा morphs की भौगोलिक दृष्टि से अलग आबादी के होते है सिएरा डेल abra inhabiting और पूर्वोत्तर मेक्सिको3के अंय क्षेत्रों । एक कई गुफा से जुड़े लक्षण एक. mexicanusमें, बदल ऑक्सीजन की खपत, depigmentation, आंखों की हानि, और बदल खिला और foraging व्यवहार सहित की पहचान की गई है4,5,6, 7,8,9. ए mexicanus एक अच्छी तरह से परिभाषित विकासवादी इतिहास, पारिस्थितिक पर्यावरण के एक विस्तृत लक्षण वर्णन के कारण अभिसरण विकास के तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रस्तुत करता है, और स्वतंत्र रूप से विकसित गुफा की उपस्थिति आबादी10,11। गुफा के कई लक्षण है कि cavefish में मौजूद हैं, आंख की हानि, नींद की कमी, वृद्धि खिला, स्कूली शिक्षा के नुकसान, कम आक्रामकता, और कम तनाव की प्रतिक्रियाएं शामिल हैं, स्वतंत्र मूल के माध्यम से कई बार विकसित किया है, अक्सर उपयोग गुफा8,12,13,14,15के बीच विभिन्न आनुवंशिक रास्ते । यह दोहराया विकास ए mexicanus प्रणाली का एक शक्तिशाली पहलू है और कैसे आनुवंशिक प्रणाली के लिए समान phenotypes उत्पंन क्षुब्ध हो सकता है के अधिक सामांय प्रश्न में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
जबकि जीन समारोह की यंत्रवादी जांच के लिए आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के आवेदन कई मछली प्रजातियों में सीमित किया गया है ( ए mexicanusसहित), zebrafish में हाल ही में अग्रिमों मछली में आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के विकास के लिए एक आधार प्रदान 16,17,18,19,20। कई उपकरण व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए zebrafish में इस्तेमाल कर रहे हैं, और इन प्रक्रियाओं के कार्यांवयन के लंबे समय मानकीकृत किया गया है । उदाहरण के लिए, एक कोशिका चरण चुनिंदा ब्लॉकों आरएनए पर morpholino oligos (MOs) के इंजेक्शन और विकास के दौरान एक संक्षिप्त अस्थाई खिड़की के लिए अनुवाद से बचाता है21,22। इसके अलावा, जीन संपादन दृष्टिकोण, जैसे संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/CRISPR-associated प्रोटीन 9 (Cas9) और ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरक जैसे effector न्यूक्लेज (TALEN), परिभाषित विलोपन की पीढ़ी के लिए अनुमति या, कुछ मामलों में,19,20,23,24जीनोम में एक पुनर्संयोजन के माध्यम से निवेशन । पारजनन का उपयोग कोशिका-प्रकार विशिष्ट तरीके से स्थिर जीन व्यंजक या फलन में हेरफेर करने के लिए किया जाता है । Tol2 प्रणाली का प्रयोग ट्रांसजेनिक जानवरों को एक Tol2 डीएनए प्लाज्मिड जिसमें ट्रांसजीन25,26शामिल है Tol2 प्रणाली medaka के Tol2 transposase का इस्तेमाल करने के लिए ट्रांसजेनिक construct17 के स्थिर कोशिका जो जर्मलाइन निवेशन उत्पंन करते हैं । Tol2 पराजीनी एक प्लाज्मिड Tol2 एकीकरण साइटों और Tol2 transposase17के लिए mrna द्वारा flanked युक्त coinjecting शामिल है । इस प्रणाली के लिए zebrafish में ट्रांसजेनिक लाइनों की एक सरणी उत्पंन इस्तेमाल किया गया है और इसके उपयोग हाल ही में अतिरिक्त आपात मॉडल सिस्टम को विस्तारित, सहित चिचिल्ड, killifish, stickleback, और, और हाल ही में, मैक्सिकन cavefish27, 28,29,30।
जबकि cavefish विशेषता विकास के तंत्र elucidating के लिए एक आकर्षक जैविक प्रणाली है, एक विकासवादी मॉडल के रूप में अपनी पूरी क्षमता पूरी तरह से इस्तेमाल नहीं किया गया है । यह आंशिक रूप से एक आनुवंशिक और सेलुलर समारोह सीधे हेरफेर करने में असमर्थता के कारण किया गया है31। उम्मीदवार जीन को विनियमित जटिल लक्षण मात्रात्मक विशेषता loci (qtl) अध्ययन का उपयोग कर की पहचान की गई है, लेकिन इन उंमीदवार जीन के सत्यापन मुश्किल गया है३२,३३,३४। हाल ही में, क्षणिक पछाड़ना morpholinos का उपयोग कर, जीन संपादन crispr और talen सिस्टम का उपयोग कर, और Tol2-mediated transgenesis के उपयोग के लिए आनुवंशिक लक्षण की संख्या में अंतर्निहित आधार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है३५,३६,३७ ,३८. कार्यांवयन और इन तकनीकों के मानकीकरण के जोड़तोड़ कि आणविक और जैविक लक्षण के तंत्रिका मद जीन समारोह के हेरफेर, परिभाषित सेल आबादी के लेबल सहित, पूछताछ के लिए अनुमति देगा और फंक्शनल रिपोर्टर्स की अभिव्यक्ति । जबकि जीन या सेलुलर समारोह में हेरफेर करने के लिए इन आनुवंशिक उपकरणों के सफल कार्यांवयन आपात मॉडल प्रणालियों में प्रदर्शन किया गया है, विस्तृत प्रोटोकॉल अभी भी एक. mexicanusमें कमी कर रहे हैं ।
ए मेक्सिकैनस एक बदलते वातावरण के जवाब में विकास के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते है और उपंयास विविध लक्षण विनियमन जीन की पहचान करने का अवसर प्रस्तुत करते हैं । कई कारकों का सुझाव है कि एक. mexicanus स्थापित जीनोमिक उपकरण स्थापित आनुवंशिक मॉडल में वर्तमान में उपलब्ध है, आसानी से प्रयोगशालाओं में मछली को बनाए रखने की क्षमता सहित लागू करने के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक मॉडल है, बड़े चिंता आकार, पारदर्शिता, एक sequenced जीनोम, और परिभाषित व्यवहार३९assays हैं । यहां, हम morpholinos के उपयोग के लिए एक पद्धति का वर्णन, transgenesis, और सतह और एक. mexicanusकी गुफा आबादी में जीन संपादन । एक. mexicanus में इन उपकरणों के व्यापक आवेदन विकास, शारीरिक, और cavefish और सतह मछली के बीच व्यवहार के अंतर के विकास के अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं में एक यंत्रवादी जांच के लिए अनुमति देगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम morpholinos का उपयोग कर जीन समारोह में हेरफेर के लिए एक पद्धति प्रदान की, CRISPR/Cas9 जीन संपादन, और transgenesis पद्धति. आनुवंशिक प्रौद्योगिकी के धन और zebrafish में इन पद्धतियों के अनुकूलन की संभावना को कम५२के सा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक sunishka ठाकुर जीनोटाइपिंग और इमेजिंग oca2 उत्परिवर्ती मछली में उसकी सहायता के लिए धंयवाद चित्रा 2में चित्रित । इस काम के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) पुरस्कार १६५६५७४ से A.C.K., जे और A.C.K. को NSF पुरस्कार १७५४३२१, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) पुरस्कार R21NS105071 A.C.K. और E.R.D. के लिए समर्थन किया था
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
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