Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur
Summary
Primaire acinaire cel isolatie, eiwit expressie of activiteit modulatie, cultuur en stroomafwaarts toepassingen zijn heel nuttig in de ex vivo studie van acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), een vroege evenement in de ontwikkeling van alvleesklierkanker.
Abstract
De differentiatie van acinaire cellen naar ductaal cellen tijdens pancreatitis en in de vroege ontwikkeling van pancreatic kanker is een belangrijke proces dat verdere studie vereist. Om te begrijpen van de mechanismen biedt reguleren acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), ex vivo 3D cultuur en differentiatie van primaire acinaire cellen naar ductaal cellen vele voordelen ten opzichte van andere systemen. Met de techniek hierin is modulatie van eiwit expressie eenvoudig en snel, waarbij slechts één dag te isoleren, stimuleren of viraal besmetten, en beginnen met het kweken van primaire acinaire cellen om te onderzoeken het ADM-proces. In tegenstelling tot via kelder membraan matrix, het zaaien van acinaire cellen clusters in collageen ik extracellulaire matrix, kunt acinaire cellen te behouden hun acinaire identiteit voor manipulatie. Dit is cruciaal bij het testen van de bijdrage van de verschillende onderdelen aan de inductie van ADM. Niet alleen zijn de gevolgen van cytokines of andere ectopically door de overheid gereguleerde factoren testbare via deze techniek, maar de bijdrage van de gemeenschappelijke mutaties, verhoogde eiwit expressie of knockdown van eiwit expressie is testbare via virale infectie van primaire acinaire cellen, met behulp van adenovirale of lentivirale vectoren. Bovendien cellen kunnen worden opnieuw afgezonderd van collageen of kelder membraan matrix op het eindpunt en geanalyseerd voor eiwit expressie.
Introduction
Acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM) is een beschermend mechanisme tijdens pancreatitis en een belangrijke proces rijden van pancreatic kanker ontwikkeling1 waarvoor verdere mechanistische inzicht. Ontsteking-geïnduceerde ADM weliswaar omkeerbare2, oncogene KRAS mutaties, die in 90% van pancreatic kanker gevallen3aanwezig zijn, te voorkomen dat differentiatie terug naar een acinaire fenotype4,5, 6. Culturing en differentiatie van primaire acinaire cellen in ductaal cellen in 3D cultuur zorgt voor de studie van de moleculaire mechanismen tot regeling van het ADM-proces, dat is moeilijk om te studeren in vivo. Dergelijke ex vivo studies inschakelen visualisatie in real time van ADM, de bestuurders en de regelgevers. Diverse stuurprogramma’s van de ADM-proces, evenals de mechanistische inzicht op hun downstream signaalroutes, zijn geïdentificeerd of geverifieerd met behulp van de hier beschreven methode. Deze omvatten ADM inductie door TGF-α (alpha-transformatie groeifactor)-gemedieerde uitdrukking van MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) en activering van Inkeping7, evenals RANTES (geregeld op activering, normale T cel uitgedrukt en uitgescheiden; ook bekend Als chemokine ligand 5 of CCL5) en TNFα (tumor necrose factor Alfa)-geïnduceerde ADM via activering van NF-recombination (nucleaire factor-recombination)8. Een extra bemiddelaar van ADM is oncogene KRas9,10, waardoor een stijging van de oxidatieve stress die vergroot het ADM-proces door middel van de verhoogde expressie van EGFR (epidermale groeifactor receptor) en de liganden, EGF) epidermale groeifactor) en TGF-α11.
Terwijl het gebruik van pancreatic kanker cellijnen is gebruikelijk voor in vitro studies, bieden primaire celculturen vele voordelen. Bijvoorbeeld, primaire acinaire cellen van niet-transgene muizen of muizen herbergen initiatiefnemende mutaties, zoals KrasG12D, zijn het meest geschikte model voor het bestuderen van de vroege gebeurtenis van ADM, omdat de cellen enkele en gecontroleerde mutaties hebben, die bekend is dat ze aanwezig zijn in het begin van pancreatic kankerontwikkeling. Dit is in tegenstelling tot vele alvleesklierkanker cellijnen die meerdere mutaties hebben en gevarieerd expressie gebaseerd op passage nummer12. Bovendien zijn de signaalroutes geïdentificeerd door daartoe geverifieerd door dierproeven. Een waarschuwing van het gebruik van primaire acinaire cellen is dat ze niet kunnen zijn transfected als typische kanker cellijnen kunnen.
De methode hierin een overzicht van de technieken van acinaire cel isolatie, 3D cultuur die ADM bootst door het toevoegen van stimulerende middelen of modulerende eiwit expressie via adenovirale of lentivirale infectie, evenals opnieuw isolatie van cellen op het eindpunt voor verdere analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
De relatief korte hoeveelheid tijd voor isolatie, infectie en primaire acinaire cellen plating is een voordeel van deze methode. Daarentegen weinig hands-on tijd kweken acinaire cellen van een uitvloeisel explant vereist, maar het duurt zeven dagen voor de uitgroei van acinaire cellen13. Een alternatieve protocol voor acinaire isolatie14 merkt een zeer korte methode voor het verkrijgen van acinaire cellen; EFG is echter een essentiële component in de acinaire cellen bij ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de R01 (CA200572) van de NIH naar Psalm De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Cancer Institute of financiers had geen rol in de nationale instituten van Health.The ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besluit om te studeren publiceren, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Recherche en cancérologie. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
