Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale
Summary
Isolamento primario delle cellule acinose, modulazione di espressione o attività di proteina, cultura e applicazioni a valle sono abbondantemente utili nell’ex vivo uno studio del metaplasia acinoso–duttale (ADM), un evento iniziale nello sviluppo del cancro del pancreas.
Abstract
La differenziazione delle cellule acinose a cellule duttali durante la pancreatite e l’inizio dello sviluppo del cancro del pancreas è un processo chiave che richiede ulteriore studio. Per comprendere i meccanismi di regolazione metaplasia acinoso–duttale (ADM), ex vivo di cultura 3D e differenziazione delle cellule acinose primarie a cellule duttali offre molti vantaggi rispetto ad altri sistemi. Con la tecnica qui, modulazione dell’espressione della proteina è semplice e veloce, che richiede un solo giorno per isolare, stimolare o viralmente infettare e iniziare la coltura delle cellule acinose primarie per studiare il processo ADM. A differenza dell’utilizzo di matrice della membrana basale, la semina dei mazzi delle cellule acinose in collagene extracellulare, permette che le cellule acinose mantengono la loro identità acinose prima manipolazione. Ciò è vitale quando si verifica il contributo delle varie componenti all’induzione di ADM. Non solo sono gli effetti delle citochine o altri fattori ectopically amministrati testabile attraverso questa tecnica, ma il contributo di comuni mutazioni, proteina aumentata espressione o atterramento di espressione della proteina è verificabile tramite l’infezione virale di cellule acinose primarie, utilizzando vettori adenoviral o lentivirali. Inoltre, le cellule possono essere ri-isolate da collagene o matrice della membrana basale all’endpoint e analizzati per l’espressione della proteina.
Introduction
Acinoso-ductal metaplasia (ADM) è un meccanismo protettivo durante un processo chiave Guida di sviluppo di cancro del pancreas1 che richiede ulteriore visione meccanicistica e pancreatite. Mentre l’infiammazione indotta ADM è reversibile2, oncogeniche mutazioni di KRAS , che sono presenti nel 90% dei casi di cancro del pancreas3, impedire differenziazione torna a un fenotipo acinose4,5, 6. Culturing e differenziazione di cellule acinose primarie in cellule duttali in 3D cultura permette per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano il processo ADM, che è difficile da studiare in vivo. Tali ex vivo studi abilitare la visualizzazione in tempo reale di ADM, i suoi piloti e suoi regolatori. Sono stati identificati diversi piloti del processo di ADM, nonché informazioni sulle loro vie di segnalazione a valle, o verificato utilizzando il qui descritto metodo. Questi includono l’induzione di ADM da TGF-α (alfa di fattore di crescita trasformante)-mediata espressione di MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) e l’attivazione della tacca7, così come RANTES (regolato sull’attivazione, la cellula T normale espressa e secreta; anche noto come ligando chemochina 5 o CCL5) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alfa)-indotta ADM attraverso l’attivazione di NF-KB (nuclear factor-κB)8. Un ulteriore mediatore di ADM è oncogene KRas9,10, che provoca un aumento dello stress ossidativo che migliora il processo ADM attraverso l’aumentata espressione di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e suoi ligandi, EGF ( fattore di crescita epidermico) e TGF-α11.
Mentre l’uso di linee cellulari di cancro del pancreas è comune per gli studi in vitro, colture cellulari primarie offrono molti vantaggi. Per esempio, le cellule acinose primarie da topi non transgenica o topi che harboring le mutazioni d’iniziale, ad esempio KrasG12D, sono il modello più appropriato per studiare l’evento iniziale di ADM perché le cellule hanno mutazioni pochi e controllate, che sono noti per essere presente all’inizio dello sviluppo di cancro del pancreas. Questo è in contrasto con molte linee cellulari di cancro del pancreas che hanno mutazioni multiple e varie espressione basata sul passaggio numero12. Inoltre, le vie di segnalazione identificate da tali mezzi sono state verificate da studi sugli animali. Un avvertimento di usando le cellule acinose primarie è che essi non possono essere transfected come linee cellulari del cancro tipico possono.
Il metodo qui in dettaglio le tecniche di isolamento di cellule acinose, cultura 3D che imita ADM aggiungendo stimolanti o modulazione dell’espressione di proteine tramite infezione adenoviral o lentivirale, come pure re-isolamento delle cellule presso l’endpoint per ulteriori analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La relativamente breve lasso di tempo per isolamento, infezione e placcatura primario delle cellule acinose è un vantaggio di questo metodo. Al contrario, coltura delle cellule acinose da una conseguenza di espianto richiede poco tempo hands-on, ma sono necessari sette giorni per la conseguenza di cellule acinose13. Protocollo alternativo per isolamento acinose14 note un metodo molto breve per l’ottenimento di cellule acinose; Tuttavia, l’EGF è un componente essenziale ne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da una sovvenzione di R01 (CA200572) da NIH al PS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell’Istituto nazionale del cancro o di istituti nazionali di Health.The, i finanziatori non avevano alcun ruolo in studio progettazione, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Recherche en cancérologie. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
