الامتزاز بوغ كنظام عرض نونريكومبينانت للإنزيمات والمضادات
Summary
ويركز هذا البروتوكول على استخدام الجراثيم البكتيرية كأداة نانوبيوتيتشنولوجيكال “حية” الجسميات جزيئات مغايرة مع مختلف الأنشطة البيولوجية. وترد أيضا أساليب لقياس كفاءة الامتزاز.
Abstract
بوغ البكتيرية خلية أيضي هادئة، يتكون من سلسلة من الطبقات الواقية المحيطة السيتوبلازم المجففة. يجعل في بوغ مستقرة للغاية ومقاومة هذا الهيكل غريبة وقد اقترح استخدام بوغ كمنصة لعرض جزيئات مغايرة. وحتى الآن، تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات على أبواغ عصيات نجحت ، وعدد قليل من الأنواع الأخرى، في البداية بنهج المؤتلف، ومن ثم، باستخدام أسلوب نونريكومبينانت بسيطة وفعالة. ويستند نظام العرض نونريكومبينانت الامتزاز المباشر من جزيئات مغايرة على السطح بوغ، تجنب بناء سلالات المؤتلف والإفراج عن البكتيريا المعدلة وراثيا في البيئة. استقرت الجزيئات الممتزة والمحمية بالتفاعل مع الجراثيم، مما يحد من التدهور السريع لمولدات المضادات، والخسارة في نشاط إنزيم في ظروف غير مواتية. متى تستخدم، يمكن جمعها بسهولة مع تخفيض الحد أدنى من نشاط الإنزيمات تمتز بوغ واستخدامها لجولات إضافية للرد. يرد في هذه الورقة كيف أن الجسميات الجزيئات النموذجية لجراثيم المنقي من باء-نجحتوكيفية تقييم كفاءة الامتزاز وكيفية جمع الجراثيم المستخدمة إعادة تدويرها لردود فعل جديدة.
Introduction
عرض النظم تهدف إلى تقديم النشيطة بيولوجيا الجزيئات على السطح للكائنات الحية الدقيقة وإيجاد التطبيقات في مجموعة متنوعة من المجالات، من الصناعي للتكنولوجيات الأحيائية الطبية والبيئية. وبالإضافة إلى فاجيس1،2 وخلايا مختلفة الغرام-وإيجابية الأنواع3،4،5،،من67، كانت أيضا الجراثيم البكتيرية اقترحه كأنظمة العرض نهجين8،9.
بسبب هيكلها غريبة، هي المجففة السيتوبلازم محاطة بسلسلة من10من طبقات واقية، بوغ يوفر العديد من المزايا بالعاثية-ويستند إلى الخلية عرض نظم8،9. ميزة أولى يأتي من الشدة القصوى واستقرار الجراثيم في الظروف التي تكون ضارة لكل أخرى الخلايا10،11. عرض بوغ المستضدات والأنزيمات مستقرة بعد التخزين في درجة حرارة الغرفة12 لفترات طويلة، والحماية من تدهور في درجة الحموضة منخفضة وارتفاع درجات الحرارة13. وميزة ثانية للجراثيم هو سلامة العديد من الأنواع تشكيل بوغ. باء-نجحت، كلاوسي، كواجولانس باء، والعديد من الأنواع الأخرى المستخدمة في جميع أنحاء العالم البروبيوتيك وقد تم في السوق للاستخدام البشري أو الحيواني لعقود14،15. هذا سجل سلامة استثنائية شرط عامة واضحة لنظام عرض سطحي ويتسم بأهمية خاصة عند النظام معد للاستخدام البشري أو الحيواني16. ثالث، هو ميزة هامة لنظام العرض القائم على بوغ أن ليس لديه قيود الحجم جزيء التي قد يتعرض. في الأنظمة المستندة إلى بالعاثية، بروتين مغايرة كبيرة قد تؤثر على الهيكل من قفيصه، بينما في الأنظمة المستندة إلى الخلية، فإنه قد تؤثر على هيكل الغشاء أو قد حد/تنال الخطوة إزفاء غشاء17. الطبقات الواقية المحيطة بوغ تتألف من أكثر من 70 البروتينات المختلفة10 وهي مرنة بما يكفي لقبول كبير البروتينات الخارجية دون أي خلل هيكلي واضح أو إعاقة وظيفية8. وبالإضافة إلى ذلك، مع كل أنظمة العرض القائم على بوغ، إزفاء غشاء من البروتين مغايرة ليس مطلوب8،9. في الواقع، البروتينات مغايرة هي أما أنتجت في السيتوبلازم الخلية الأم وتجميعها في بوغ أن يتشكل في السيتوبلازم نفسه أو تمتز على8،بوغ ناضجة9.
في البداية حصل عرض بوغ وضع نظام وراثية مهندس السطحية سبور18. يستند هذا النظام الوراثي أنا) بناء التحام الجينات بين ترميز الجينات لبروتين معطف سبور (تستخدم ناقل) وترميز الجينات للبروتين أن يكون عرض-وجود إشارات النسخي ومتعدية الجنسيات ذاتية سيتم التحكم في الجينات تعبير الانصهار، والثاني) التكامل تشيميريك الجينات على كروموسوم ب-نجحت منح الاستقرار الوراثي. وقد تم عرض مجموعة متنوعة من مولدات المضادات، والأنزيمات بهذا النهج المؤتلف، استخدام مختلف البروتينات السطحية بوغ الناقلين وتهدف مختلف التطبيقات المحتملة، تتراوح بين لقاح المخاطية بيوكاتاليست، بيوسينسور، والمعالجة البيولوجية، أو بيواناليتيكال أداة8،13.
في الآونة الأخيرة، تم اتباع نهج مختلف لعرض سبور19من البلدان المتقدمة النمو. هذا النظام الثاني هو نونريكومبينانت، ويعتمد على الامتزاز عفوية وضيق للغاية من الجزيئات على السطح سبور9. المستضدات19،20 والأنزيمات13،21 أظهروا كفاءة وقد كشفت عن أن هذا الأسلوب إلى حد كبير أكثر كفاءة من المؤتلف. هذا النهج نونريكومبينانت يتيح عرض البروتينات في النموذج الأصلي20 ويمكن أن تستخدم أيضا مع يعقم، وموت الجراثيم19. الآلية الجزيئية الامتزاز لم تماما يتضح حتى الآن. شحنة سالبة و hydrophobicity بوغ اقترحت كخصائص ذات صلة لل19،13،الامتزاز22. في الآونة الأخيرة، قد ثبت أن نموذج بروتين، البروتين أوتوفلوريسسينت الأحمر (مرفب) للشعاب المرجانية ديسكوسوما، عندما تمتز إلى بوغ، تمكنت من التسلل عبر الطبقات السطحية إضفاء الطابع المحلي في معطف الداخلية23. الترجمة الداخلية من البروتينات مغايرة إذا ثبت صحيحاً للبروتينات الأخرى، يمكن أن يفسر زيادة الاستقرار عندما تمتز إلى جراثيم23.
في دراسة أجريت مؤخرا، عامين الإنزيمات تحفيز الخطوات المتتابعة اثنين من مسار التدهور زيلان تم عرضها بشكل مستقل على جراثيم من باء-نجحت ، وعندما المحتضنة معا، كانت قادرة على القيام بكل الخطوات تدهور21. الجراثيم التي جمعت بعد رد فعل كانت لا تزال نشطة وقادرة على مواصلة تدهور زيلان عند إضافة الركازة جديدة21. حتى لو كان قد لوحظ فقدان حوالي 15% المنتج النهائي في الرد الثاني21، إعادة استخدام الإنزيمات الممتزة لردود فعل واحد، فضلا عن الخطوة متعددة، ميزة هامة إضافية من نظام العرض بوغ.
وأفادت عموم et al.24 نهج إضافية لعرض مغايرة البروتينات على سطح بوغ: البروتينات مغايرة (بروتين اندوجلوكاناسي وبيتا-جالاكتوسيداسي واحدة) تنتج في الخلية الأم خلال تبوغ كانت عفوية المغطى في تشكيل معطف بوغ، دون الحاجة إلى الناقل. هذا النظام عرض إضافية بوغ مزيج من النهجين وصف حتى الآن. وفي الواقع، أنها المؤتلف منذ كانت هندسة البروتينات مغايرة ليمكن التعبير عنها في الخلية الأم خلال تبوغ، بينما كانت هذه الجمعية داخل المعطف عفوية، ومن ثم نونريكومبينانت24. ومع ذلك، يظل كفاءة عرض هذا النهج الإضافية لفحصها ومقارنة مع هذين النهجين الآخرين باستخدام نفس البروتينات مغايرة.
هذا البروتوكول لا يشمل عمليات إنتاج بوغ وتنقية، التي وصفت على نطاق واسع في أماكن أخرى24. يتضمن رد فعل الامتزاز، تقييم كفاءة الامتزاز بالفحص المجهري النشاف دوت والأسفار، وجولات إعادة التدوير للإنزيمات الممتزة لإضافية للرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول الامتزاز بوغ جداً بسيط ومباشر. أن رد الفعل يعتمد كلياً على درجة الحموضة من رد فعل المخزن المؤقت وكفاءة الامتزاز الأمثل في قيم الأس الهيدروجيني الحمضية (pH 5.0 أو أقل). في ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة، وكفاءة الامتزاز منخفض، وفي قيم الأس الهيدروجيني قلوية، وقد لا يحدث الامتز?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “فينانزيامينتو di اتينيو دي ريشيركا” للأم باكسيجالوبي، عنوان المشروع “وضع SP: الجراثيم البكتيرية كمنصة لايف لعرض البروتينات”.
Materials
| 0.1% Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| 0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Sartorius | M_Blotting_Membranes | |
| 100× objective UPlanF1 | Olympus | microscope equipment | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | |
| BD ACCURI C6 PLUS | BD | flow cytometer | |
| BX51 | Olympus | Fluorescent microscope | |
| Clarity | Biorad | 1705060 | |
| DP70 digital camera a | Olympus | microscope equipment | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC | Thermo fisher | F-2754 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody | Sigma | A7058-1VL | used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal |
| SecureSlip glass coverslip | Sigma | S1815-1PAK | |
| Superwhite Uncharged Microscope Slides | VWR | 75836-190 | |
| U-CA Magnification Changer | Olympus | microscope equipment |
References
- Felici, F., et al. Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage. Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).
- Cortese, R., et al. Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage. Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).
- Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).
- Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).
- Wu, J. Y., et al. Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).
- Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. Science. 244, 70-72 (1989).
- Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery. Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).
- Isticato, R., Ricca, E. Spore surface display. Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).
- Ricca, E., et al. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).
- Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).
- Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E., Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Display of molecules on the spore surface. Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications. , 193-200 (2004).
- Sirec, T., et al. Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 11, 100 (2012).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).
- Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E., Venema, K., Do Carmo, A. P. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends. , 93-103 (2014).
- Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics. International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).
- Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. Microbial cell-surface display. Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).
- Isticato, R., et al. Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).
- Huang, J. M., et al. Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores. Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).
- Isticato, R., et al. Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 12, 98 (2013).
- Mattossovich, R., et al. Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes. Microbial Cell Factories. 16, 218 (2017).
- Pesce, G., et al. Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).
- Donadio, G., et al. Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 15, 153 (2016).
- Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. Display of native proteins on Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).
- Cutting, S., Vander Horn, P. B., Harwood, C., Cutting, S. Genetic analysis. Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Lanzilli, M., et al. Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium. New Biotechnology. 46, 38 (2018).
