Isolering och överföring av hög salthalt behandlas Antigen-presenterande dendritiska celler

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera dendritiska celler från murina mjälte av magnetiska cell sortering och efterföljande överföring i naiva möss. Modell av hög salthalt aktiverade dendritiska celler valdes för att förklara de stegvisa procedurerna för överföring och flödescytometri.

Abstract

Överflödigt salt intaget bidrar till inflammation och spelar en viktig roll i utvecklingen av hypertoni. Vi hittade tidigare att antigen-presenterande dendritiska celler (DCs) kan känna förhöjda extracellulära natrium leder till aktivering av den NADPH-oxidasen och bildandet av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Dessa IsoLG-protein addukter reagera med self-proteiner och främja en autoimmun-liknande tillstånd och hypertoni. Vi har utvecklat och optimerat state-of-the-art metoder för att studera DC funktion vid hypertoni. Här, vi ger ett detaljerat protokoll för isolering, i vitro behandling med förhöjda natrium, och överföring av murina mjälten CD11c⁺ celler i mottagarens möss att studera deras roll vid hypertoni.

Introduction

Överflödig kost salt är en stor riskfaktor för hypertoni. ^{1 , 2} the American Heart Association rekommenderar högst 2 300 milligram (mg) natrium (Na⁺) intag per dag, dock; mindre än 10% av den amerikanska befolkningen har påpekat denna rekommendation. ^{3 , 4} blygsamma minskningar i Na⁺ intag sänker blodtrycket och minska de årliga nya fall av hjärt-kärlsjukdomar och stroke i USA med 20%. ⁵ stora problem med överflödig saltkonsumtion är att 50% av hypertonipopulationen utställningar salt-känslighet, definierades som en ökning av blodtrycket efter Na^{Na+ lastning eller en liknande blodtrycksfall med 10 mmHg +} begränsning och Diures. ⁶ salt-känslighet också förekommer i 25% av normotensiva individer och är en oberoende prediktor av död och kardiovaskulära händelser. ^{7 , 8} salt-sensing mekanismer vid hypertoni som involverar njuren har också studerats; Nyare studier antyder dock att immunceller kan känna Na⁺. ^{9 , 10}

Nyligen tyder på att förändringar i extra nedsatt Na⁺ hantering kan orsaka ansamling av Na⁺ i interstitium och främja inflammation. ^{11 , 12} vårt laboratorium och andra har visat att celler både medfödd och adaptiv immunsystemet bidrar till Förvärrande av hypertoni. ^{9 , 13 , 14 , 15} olika hypertensiva stimuli, inklusive angiotensin II, noradrenalin och salt orsak makrofager, monocyter och T-lymfocyter att infiltrera njurarna och blodkärlen och främja Na⁺ lagring, vasokonstriktion, blodtryck höjd och organskada. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} i tidigare studier fann vi att DCs ackumulerar isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter som svar på olika hypertensiva stimuli inklusive angiotensin II och DOCA-salt hypertoni. ¹⁴ IsoLGs är mycket reaktiva produkter av lipidperoxidation som snabbt och kovalent addukt till lysines på proteiner och deras anhopning är associerad med DC aktivering. ¹⁴ vi har nyligen fastställt att förhöjda Na⁺ är en potent stimulans för IsoLG-protein addukt bildandet i murin DCs.⁹ Na⁺ trätt i DCs medieras genom amilorid känsliga transportörer. Na⁺ växlas sedan kalcium (Ca^{2 +}) via Na⁺/ca^{2 +} värmeväxlaren. Ca^{2 +} aktiverar proteinkinas C (PKC) som aktiverar den NADPH-oxidas som leder till ökad superoxid (O₂^{· –}) och IsoLG-protein addukt bildandet. ⁹ överföring av salt-exponerade DCs primtal hypertoni som svar på en sub Blodtryckshöjande dos av angiotensin II. ⁹

Identifiering av CD11c⁺ DCs från vävnader har tidigare begränsats till immunhistokemi och RT-PCR och isolering av DCs har begränsats till cellen sortera av flödescytometri. Även om flödet flödescytometri cell sortering är en kraftfull metod för isolering av immunceller, det är dyrt, tidskrävande, och leder till en låg avkastning av viabla celler. Därför vi har optimerat ett steg protokoll för vävnad matsmältningen, in vitro-stimulering och överföring av CD11c⁺ DCs att studera hypertoni.

Protocol

Vanderbilt Universitys institutionella djur vård och användning kommittén har godkänt de förfaranden som beskrivs häri. Möss är inrymt och vårdas enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur (nationella akademier tryck. Reviderad 2010). 1. isolering av mjälte från möss Förbereda 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium Pyruvat, 50 µM β-merkaptoetanol och 1% penicillin/streptomycin. Avliva 10 – 12 veckors-gamla C57bl/6 hanmöss av CO<s…

Representative Results

Figur 1 representerar en schematisk av beskrivs stegen ovan. Isolerade murina mjälte sorteras för CD11c+ DCs av magnetiska cell sortering och klädd i normala salt media (NS; 150 mmol NaCl) eller hög salt media (HS; 190 mmol NaCl) för 48 h. CD11c+ DCs överförs därefter adoptively av retro-orbital injektion till naiva mottagarens möss. Tio dagar senare, implanteras möss med osmotisk men framförallt minipumpar precis vid infusion…

Discussion

I det nuvarande protokollet, vi har optimerat förfaranden för att isolera CD11c⁺ DCs från mjälte möss och adoptively överföra dem till naiva djur att studera DCs roll i salt-inducerad hypertoni. Detta protokoll kan anpassas att isolera och adoptively överföra andra immunceller undergrupper bland annat makrofager och monocyter adaptiv immunceller inklusive T- och B-lymfocyter. Vi har optimerat mjälten rötningsprocessen för att uppnå tillräcklig cellöverlevnad och stabilitet av DC ytan uttryck mar…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030