Prøveforberedelse til masse-massespektrometri-baseret Proteomics analyser af okulær Microvessels
Summary
Proteom karakterisering af okulær mikrovaskulære senge er afgørende for dybdegående forståelse af mange okulær sygdomme hos mennesker. Denne undersøgelse viser en effektiv, hurtig og robust metode for protein udvinding og forberedelse af prøver fra små blodkar, der beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier som model skibe til masse-massespektrometri-baseret proteomics analyser.
Abstract
Brug af isolerede okulær blodkar in vitro-at dechifrere den patofysiologiske tilstand i øjet ved hjælp af avancerede teknologiske metoder har stærkt udvidet vores forståelse af visse sygdomme. Massespektrometri (MS)-baseret proteomics fremstod som et kraftfuldt værktøj til at optrævle ændringer i de molekylære mekanismer og protein signalering veje i de vaskulære senge i sundhed og sygdom. Prøven forberedelsestrin før MS analyser er imidlertid afgørende at få reproducerbare resultater og grundig udredning af det komplekse proteomet. Dette er især vigtigt for forberedelse af okulær microvessels, hvor mængden af prøven til analyser er ofte begrænset og således udgør en udfordring for optimal protein udvinding. Denne artikel bestræber sig på at yde en effektiv, hurtig og robust protokol for forberedelse af prøver fra en eksemplarisk retrobulbær okulær vaskulære seng beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier. De nuværende metode fokuserer på protein ekstraktion procedurer fra både supernatanten og pellet af prøven efter homogenisering, prøve rengøring med centrifugal filter anordningerne inden endimensional gel elektroforese og peptid rensning trin til label-fri kvantificering i en liquid chromatography-electrospray Ionisation-lineær ion trap-Orbitrap MS system. Selvom denne metode er blevet udviklet specielt til proteomics analyser af okulær microvessels, har vi også givet overbevisende beviser for at det kan også være let ansat til andre væv-baserede prøver.
Introduction
Avancement inden for proteomics, hvilke tilladelser integreret og uovertruffen data indsamling magt, har stærkt revolutioneret vores forståelse for de molekylære mekanismer bag visse sygdomstilstande samt som afspejler den fysiologiske tilstand af en bestemt celle population eller væv1,2,3,4. Proteomics har også vist sig for at være en vigtig platform i oftalmologiske forskning på grund af følsomhed og uvildig analyse af forskellige okulær prøver, at den lettere identifikation af potentielle sygdom markører til endelige diagnose og prognose, som fremgår elegant af mange undersøgelser i de seneste år, herunder nogle af vores1,5,6,7,8,9,10. Det er dog ofte vanskeligt at opnå menneskelige prøver for proteom analyser af etiske grunde, især i betragtning af behovet for kontrolmateriale fra raske personer for pålidelig komparative analyser. På den anden side er det også udfordrende at opnå tilstrækkelig mængde af prøver for optimal og pålidelig massespektrometrisk analyser. Dette er især vigtigt for masse-begrænsede biologiske materialer såsom mikro-blodkar i øjet. En sådan større retrobulbær blodkar, som spiller afgørende roller i reguleringen af okulær blodgennemstrømningen er den korte bageste ciliaere arterie (sPCA). Enhver undertrykkelse af netbårne eller uregelmæssigheder i denne vaskulære seng kan resultere i alvorlige kliniske konsekvenser, hvilket kan føre til patogenesen af flere sight-truende sygdomme såsom grøn stær og nonarteritic forreste iskæmisk optisk neuropati (NAION)11 , 12. men der er en manglende undersøgelser belyse proteomet ændringer i denne arteriel sengen på grund af de ovennævnte ulemper. Derfor, i de seneste år, har huset svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) opstået som en god dyremodel i oftalmologiske forskning på grund af de høje morfologiske og fylogenetiske ligheder mellem mennesker og svin13, 14,15. Svin okulær prøver er let tilgængelige og vigtigst, er mere nøjagtig repræsentation af menneskelige væv.
I betragtning af den vigtige rolle af disse blodkar i øjet, samt mangel på metodik sørget for effektiv protein udvinding og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere karakteriseret proteomet af svin sPCA ved hjælp af en in-house protokol, der resulterede i identifikation af et stort antal proteiner16. Baseret på denne undersøgelse, har vi yderligere optimeret og beskrevet dybdegående vores metodologi i denne artikel, som tillader proteomet analyse fra små mængder af prøver ved hjælp af de svin sPCA som model væv. Omend det vigtigste formål med denne undersøgelse var at etablere en MS-kompatibel metode til masse-limited okulær blodkar, har vi givet betydelige eksperimentelle bevismateriale at arbejdsprocessen beskrives også kan anvendes bredt til forskellige væv-baserede prøver.
Det er forestillede sig, at denne arbejdsproces vil være medvirkende til forberedelse af høj kvalitet MS-kompatible prøver fra små mængder af materialer til omfattende proteomet analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattende proteomet profilering af en bred vifte af okulær prøver er en vigtig og uundværlig første skridt til at belyse molekylære mekanismer og signalering veje impliceret i sundhed og sygdom. For at få data af høj kvalitet og sikre reproducerbarheden af resultaterne fra disse analyser de foregående prøve forberedelsestrin er vigtigt, som understreget i en anmeldelse af Mandal et al., diskuteres indgående prøve behandling procedurer til forskellige dele af øjet beskæftiger to-dimensionelle gel elektrofore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam er understøttet af de interne Universitet forskningsmidler (Stufe 1) fra University Medical Center af Johannes Gutenberg Universitet Mainz og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
