नेत्र सूक्ष्मवाहिकीय बिस्तरों के proteome लक्षण वर्णन मनुष्यों में कई नेत्र विकृतियों की गहराई से समझने के लिए निर्णायक है । इस अध्ययन को दर्शाता है एक प्रभावी, तेजी से, और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए मजबूत विधि और छोटे रक्त वाहिकाओं से नमूना तैयार करने के लिए मॉडल जहाजों के रूप में सुअर का लघु पीछे सिलिअरी धमनियों को रोजगार मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स विश्लेषण.
विट्रो में पृथक नेत्र रक्त वाहिकाओं का उपयोग करने के लिए आंख की pathophysiological राज्य को समझने के लिए उंनत तकनीकी दृष्टिकोण का उपयोग कर बहुत कुछ रोगों के बारे में हमारी समझ का विस्तार किया है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-आधारित प्रोटिओमिक्स एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है आणविक तंत्र और स्वास्थ्य और रोग में संवहनी बिस्तरों में प्रोटीन संकेतन रास्ते में परिवर्तन जानने के लिए. हालांकि, नमूना तैयारी कदम से पहले एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और में जटिल proteome की गहराई से आलोचनीय । यह विशेष रूप से नेत्र microvessels की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, जहां विश्लेषण के लिए उपलब्ध नमूना की मात्रा अक्सर सीमित है और इस प्रकार, इष्टतम प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक चुनौती बन गया है । इस लेख में एक अनुकरणीय रेट्रोब्लबार नेत्र संवहनी बिस्तर से नमूना तैयार करने के लिए एक कुशल, तेजी से और मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए प्रयास सुअर का कम पीछे सिलिअरी धमनियों. वर्तमान विधि से प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित दोनों सतह पर तैरनेवाला और नमूना निम्नलिखित homogenization के गोली, नमूना केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों के साथ सफाई से पहले एक आयामी जेल वैद्यरसंचलन और पेप्टाइड शुद्धि के लिए लेबल के लिए कदम-मुक्त परिमाणन में एक तरल क्रोमेटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-रैखिक आयन ट्रैप-ऑर्करैप एमएस सिस्टम । हालांकि इस पद्धति को विशेष रूप से नेत्र microvessels के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, हम भी ठोस सबूत है कि यह भी आसानी से अंय ऊतक आधारित नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है प्रदान की गई है ।
प्रोटियोमिक्स के क्षेत्र में प्रगति, जो एकीकृत और नायाब डेटा संग्रह शक्ति परमिट, बहुत कुछ रोग की स्थिति में अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ में क्र ांतिकारी परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिबिंबित में एक विशिष्ट कोशिका जनसंख्या या ऊतक1,2,3,4की शारीरिक स्थिति । proteomics भी विभिन्न नेत्र नमूनों की संवेदनशीलता और निष्पक्ष विश्लेषण है कि अंतिम निदान और रोग का निदान के लिए संभावित रोग मार्कर की पहचान की सुविधा के कारण नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण मंच साबित हो गया है, के रूप में हाल के वर्षों में कई अध्ययनों से सुंदर ढंग से सबूत, हमारा1,5,6,7,8,9,10में से कुछ सहित । तथापि, यह अक्सर नैतिक कारणों की वजह से proteomic विश्लेषण के लिए मानव नमूने प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से विश्वसनीय तुलनात्मक विश्लेषण के लिए स्वस्थ व्यक्तियों से नियंत्रण सामग्री के लिए की जरूरत पर विचार. दूसरी ओर, यह इष्टतम और विश्वसनीय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूनों को प्राप्त करना भी चुनौतीपूर्ण है । यह विशेष रूप से जन-सीमित जैविक सामग्रियों के लिए महत्वपूर्ण है जैसे कि आंख की सूक्ष्म रक्त वाहिकाओं । ऐसा ही एक प्रमुख रेट्रोब्यूलर रक्त वाहिका जो नेत्र रक्त प्रवाह के विनियमन में निर्णायक भूमिका निभाता है, वह छोटी पश् चवर्ती पित्त धमनी (एसपीसीए) है । इस संवहनी बिस्तर में कोई भी क्षोभ या विसंगतियों गंभीर नैदानिक नतीजों में परिणाम हो सकता है, जो कई दृष्टि-धमकी वाले रोगों जैसे ग्लूकोमा और नोन्टेरिटिक पूर्वकाल इस्कीमिक ऑप्टिक न्यूरोपैथी (naion) के रोगजनन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं11 , 12. हालांकि, उपर्युक्त कमियों के कारण इस धमनी बिस्तर में प्रोटीयोम परिवर्तन को कम करने वाले अध्ययनों की कमी है । इसलिए, हाल के वर्षों में, घर सूअर (Sus scrofa डोमेस्टिका linnaeus, १७५८) मानव और13सूअरों के बीच उच्च सुघड़ और जातिवृत् तीय समानताएं के कारण नेत्र अनुसंधान में एक अच्छा जानवर मॉडल के रूप में उभरा है, 14,15. porcine नेत्र नमूने आसानी से उपलब्ध हैं और सबसे महत्वपूर्ण बात, मानव ऊतकों का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.
आंख में इन रक्त वाहिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका को ध्यान में रखते हुए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कार्यपद्धति की कमी कुशल प्रोटीन निष्कर्षण और इन microvessels से विश्लेषण के लिए catered, हम पहले से सुअर का spca के proteome विशेषता है एक में घर का उपयोग प्रोटोकॉल है कि16प्रोटीन की एक उच्च संख्या की पहचान के परिणामस्वरूप । इस अध्ययन के आधार पर, हम और अधिक अनुकूलित और वर्णित में गहराई से इस लेख में हमारी पद्धति है, जो नमूनों की मिनट मात्रा से proteome विश्लेषण की अनुमति देता है मॉडल ऊतक के रूप में सुअर का spca का उपयोग । जबकि इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य जन-सीमित नेत्र रक्त वाहिकाओं के लिए एक एमएस-संगत पद्धति स्थापित करने के लिए किया गया था, हम पर्याप्त प्रयोगात्मक सबूत है कि वर्णित कार्यप्रवाह भी मोटे तौर पर विभिन्न ऊतक आधारित नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान की गई है.
यह कल्पना की है कि इस कार्यप्रवाह व्यापक proteome विश्लेषण के लिए सामग्री की छोटी मात्रा से उच्च गुणवत्ता एमएस-संगत नमूनों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी ।
आंख के नमूनों की एक विविध रेंज के व्यापक proteome रूपरेखा एक महत्वपूर्ण और अपरिहार्य पहला कदम आणविक तंत्र और संकेतन स्वास्थ्य और रोग में फंसा रास्ते को स्पष्ट करने के लिए है । आदेश में उच्च गुणवत्ता डेटा प्?…
The authors have nothing to disclose.
डॉ manicam आंतरिक विश्वविद्यालय अनुसंधान धन द्वारा समर्थित है (stufe 1) जोहान्स gutenberg विश्वविद्यालय मैंज के विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र से और ड्यूश forschungsgemeinschaft से एक अनुदान (एमए 8006/1-1).
A. Chemicals | |||
1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
B. Reagents and Kits | |||
0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
C. Tools | |||
96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
D. Equipment and devices | |||
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
Analytical balance | Sartorius | H51 | |
Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |