Summary

ocular microvessels के मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomics विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

Published: February 22, 2019
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Summary

नेत्र सूक्ष्मवाहिकीय बिस्तरों के proteome लक्षण वर्णन मनुष्यों में कई नेत्र विकृतियों की गहराई से समझने के लिए निर्णायक है । इस अध्ययन को दर्शाता है एक प्रभावी, तेजी से, और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए मजबूत विधि और छोटे रक्त वाहिकाओं से नमूना तैयार करने के लिए मॉडल जहाजों के रूप में सुअर का लघु पीछे सिलिअरी धमनियों को रोजगार मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स विश्लेषण.

Abstract

विट्रो में पृथक नेत्र रक्त वाहिकाओं का उपयोग करने के लिए आंख की pathophysiological राज्य को समझने के लिए उंनत तकनीकी दृष्टिकोण का उपयोग कर बहुत कुछ रोगों के बारे में हमारी समझ का विस्तार किया है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-आधारित प्रोटिओमिक्स एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है आणविक तंत्र और स्वास्थ्य और रोग में संवहनी बिस्तरों में प्रोटीन संकेतन रास्ते में परिवर्तन जानने के लिए. हालांकि, नमूना तैयारी कदम से पहले एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और में जटिल proteome की गहराई से आलोचनीय । यह विशेष रूप से नेत्र microvessels की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, जहां विश्लेषण के लिए उपलब्ध नमूना की मात्रा अक्सर सीमित है और इस प्रकार, इष्टतम प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक चुनौती बन गया है । इस लेख में एक अनुकरणीय रेट्रोब्लबार नेत्र संवहनी बिस्तर से नमूना तैयार करने के लिए एक कुशल, तेजी से और मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए प्रयास सुअर का कम पीछे सिलिअरी धमनियों. वर्तमान विधि से प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित दोनों सतह पर तैरनेवाला और नमूना निम्नलिखित homogenization के गोली, नमूना केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों के साथ सफाई से पहले एक आयामी जेल वैद्यरसंचलन और पेप्टाइड शुद्धि के लिए लेबल के लिए कदम-मुक्त परिमाणन में एक तरल क्रोमेटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-रैखिक आयन ट्रैप-ऑर्करैप एमएस सिस्टम । हालांकि इस पद्धति को विशेष रूप से नेत्र microvessels के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, हम भी ठोस सबूत है कि यह भी आसानी से अंय ऊतक आधारित नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है प्रदान की गई है ।

Introduction

प्रोटियोमिक्स के क्षेत्र में प्रगति, जो एकीकृत और नायाब डेटा संग्रह शक्ति परमिट, बहुत कुछ रोग की स्थिति में अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ में क्र ांतिकारी परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिबिंबित में एक विशिष्ट कोशिका जनसंख्या या ऊतक1,2,3,4की शारीरिक स्थिति । proteomics भी विभिन्न नेत्र नमूनों की संवेदनशीलता और निष्पक्ष विश्लेषण है कि अंतिम निदान और रोग का निदान के लिए संभावित रोग मार्कर की पहचान की सुविधा के कारण नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण मंच साबित हो गया है, के रूप में हाल के वर्षों में कई अध्ययनों से सुंदर ढंग से सबूत, हमारा1,5,6,7,8,9,10में से कुछ सहित । तथापि, यह अक्सर नैतिक कारणों की वजह से proteomic विश्लेषण के लिए मानव नमूने प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से विश्वसनीय तुलनात्मक विश्लेषण के लिए स्वस्थ व्यक्तियों से नियंत्रण सामग्री के लिए की जरूरत पर विचार. दूसरी ओर, यह इष्टतम और विश्वसनीय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूनों को प्राप्त करना भी चुनौतीपूर्ण है । यह विशेष रूप से जन-सीमित जैविक सामग्रियों के लिए महत्वपूर्ण है जैसे कि आंख की सूक्ष्म रक्त वाहिकाओं । ऐसा ही एक प्रमुख रेट्रोब्यूलर रक्त वाहिका जो नेत्र रक्त प्रवाह के विनियमन में निर्णायक भूमिका निभाता है, वह छोटी पश् चवर्ती पित्त धमनी (एसपीसीए) है । इस संवहनी बिस्तर में कोई भी क्षोभ या विसंगतियों गंभीर नैदानिक नतीजों में परिणाम हो सकता है, जो कई दृष्टि-धमकी वाले रोगों जैसे ग्लूकोमा और नोन्टेरिटिक पूर्वकाल इस्कीमिक ऑप्टिक न्यूरोपैथी (naion) के रोगजनन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं11 , 12. हालांकि, उपर्युक्त कमियों के कारण इस धमनी बिस्तर में प्रोटीयोम परिवर्तन को कम करने वाले अध्ययनों की कमी है । इसलिए, हाल के वर्षों में, घर सूअर (Sus scrofa डोमेस्टिका linnaeus, १७५८) मानव और13सूअरों के बीच उच्च सुघड़ और जातिवृत् तीय समानताएं के कारण नेत्र अनुसंधान में एक अच्छा जानवर मॉडल के रूप में उभरा है, 14,15. porcine नेत्र नमूने आसानी से उपलब्ध हैं और सबसे महत्वपूर्ण बात, मानव ऊतकों का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

आंख में इन रक्त वाहिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका को ध्यान में रखते हुए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कार्यपद्धति की कमी कुशल प्रोटीन निष्कर्षण और इन microvessels से विश्लेषण के लिए catered, हम पहले से सुअर का spca के proteome विशेषता है एक में घर का उपयोग प्रोटोकॉल है कि16प्रोटीन की एक उच्च संख्या की पहचान के परिणामस्वरूप । इस अध्ययन के आधार पर, हम और अधिक अनुकूलित और वर्णित में गहराई से इस लेख में हमारी पद्धति है, जो नमूनों की मिनट मात्रा से proteome विश्लेषण की अनुमति देता है मॉडल ऊतक के रूप में सुअर का spca का उपयोग । जबकि इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य जन-सीमित नेत्र रक्त वाहिकाओं के लिए एक एमएस-संगत पद्धति स्थापित करने के लिए किया गया था, हम पर्याप्त प्रयोगात्मक सबूत है कि वर्णित कार्यप्रवाह भी मोटे तौर पर विभिन्न ऊतक आधारित नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान की गई है.

यह कल्पना की है कि इस कार्यप्रवाह व्यापक proteome विश्लेषण के लिए सामग्री की छोटी मात्रा से उच्च गुणवत्ता एमएस-संगत नमूनों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी ।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु नमूनों का उपयोग दृष्टि और नेत्र विज्ञान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के लिए सख्त पालन में प्रदर्शन किया गया (arvo) नेत्र और दृष्टि अनुसंधान और संस्थागत दिशा निर्देशों के …

Representative Results

सीमित नमूना उपलब्धता नेत्र अनुसंधान में प्रमुख खामियों में से एक है । तदनुसार, इस तरह के नेत्र रक्त वाहिकाओं के रूप में नमूनों की छोटी मात्रा से इष्टतम प्रोटीन उपज के लिए निष्कर्षण तरीकों ?…

Discussion

आंख के नमूनों की एक विविध रेंज के व्यापक proteome रूपरेखा एक महत्वपूर्ण और अपरिहार्य पहला कदम आणविक तंत्र और संकेतन स्वास्थ्य और रोग में फंसा रास्ते को स्पष्ट करने के लिए है । आदेश में उच्च गुणवत्ता डेटा प्?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

डॉ manicam आंतरिक विश्वविद्यालय अनुसंधान धन द्वारा समर्थित है (stufe 1) जोहान्स gutenberg विश्वविद्यालय मैंज के विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र से और ड्यूश forschungsgemeinschaft से एक अनुदान (एमए 8006/1-1).

Materials

A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 1.11474
Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) Sigma-Aldrich 5.33005
Calcium chloride dihydrate (CaCl2  Carl Roth  5239.1 2.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)  Thermo Fisher Scientific 14190169
Formic acid (CH2O2) AppliChem A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) AppliChem A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH) Fisher Scientific M/4056/17
HPLC-grade water  AppliChem A1589
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I6125
Kalium chloride (KCl)   Carl Roth  6781.1 4.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)  Carl Roth  3904.2 1.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid  Carl Roth  AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)    Carl Roth  261.2 1.2 mM 
NuPAGE Antioxidant Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0007 4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0002 20x
NuPAGE Sample reducing agent  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0004 10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC5925
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium chloride (NaCl)  Carl Roth  9265.2 118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)  Carl Roth  965.3 25 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2) Merck Millipore 108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate  Carl Roth  6780.1 11 mM 
B. Reagents and Kits
0.5mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB05
1.0mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC6025 To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0321BOX 1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK Merck Millipore 71772-3 20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) Thermo Scientific 78510
C. Tools
96-well V-bottom plates Greiner Bio-One 651180
Corning 96-well flat-bottom plates Sigma-Aldrich CLS3595-50EA
Disposable microtome blades pfm Medical 207500014
Disposable scalpels #21 pfm Medical 200130021
Dissection pins  Carl Roth PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors  Fine Science Tools 14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Mayo scissors, Tough cut  Fine Science Tools 14130-17
Precision tweezers  Fine Science Tools 11251-10 Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips Carl Roth LH53.1 Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates Ratiolab (vWR) RATI6018412
Standard pattern forceps  Fine Science Tools 11000-12
Student Vannas spring scissors  Fine Science Tools 91501-09
Vannas capsulotomy scissors   Geuder 19760  Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips Merck Millipore ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column  Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices  Merck Millipore UFC500396 Pack of 96.
Analytical balance Sartorius H51
Autosampler  CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm  Next Advance NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301 Sigma-Aldrich Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424 Fisher Scientific 05-403-93 Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge Thermo Scientific 75005440 Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer  Sartorius BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro Thermo Scientific, Rockford, USA 22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer  Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader  Thermo Labsystems v2.6
Rotator with vortex  neoLab 7-0045
Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) Sartorius BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31 Bandelin 329
Xcell Surelock Mini Cell Life Technologies El0001

References

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Citer Cet Article
Perumal, N., Straßburger, L., Schmelter, C., Gericke, A., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Manicam, C. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (144), e59140, doi:10.3791/59140 (2019).

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