Eksempel forberedelse til masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyse av okulære Microvessels
Summary
Proteom karakteristikk av okulære mikrovaskulær senger er avgjørende for grundig forståelse av mange okulær patologi hos mennesker. Denne studien viser en effektiv, rask og robust metode for protein utvinning og prøve forberedelse fra små blodkar ansette svin kort bakre ciliary arteriene som modell fartøy for masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyser.
Abstract
Bruk av isolerte okulær blodkar i vitro å dechiffrere patofysiologiske delstaten øyet ved hjelp av avanserte teknologiske tilnærminger er betydelig utvidet vår forståelse av visse sykdommer. Massespektrometri (MS)-basert Proteomikk har dukket opp som et kraftig verktøy for å løse endringer i molekylære mekanismer og signalnettverk trasé i vaskulær senger i helse og sykdom protein. Eksempel forberedelsene før MS analyser er imidlertid avgjørende reproduserbar resultater og grundig forklaring av den komplekse proteom. Dette er spesielt viktig for utarbeidelse av okulære microvessels, der eksemplar tilgjengelig for analyser er ofte begrenset og dermed utgjør en utfordring for optimal protein utvinning. Denne artikkelen forsøker å gi en effektiv, rask og robust protokoll for eksempel forberedelse fra en eksemplarisk retrobulbar okulær vaskulær seng ansette svin kort bakre ciliary arteriene. De nåværende metoden fokuserer på protein utvinning prosedyrer fra både nedbryting og pellet på utvalget etter homogenisering prøve rengjøring med sentrifugal filter enheter før endimensjonal gel gelelektroforese og peptid rensing trinn for etikett-fri kvantifisering i en væske kromatografi-electrospray ionization-lineær ion felle-Orbitrap MS system. Selv om denne metoden har blitt utviklet spesifikt for Proteomikk analyser av okulære microvessels, har vi også gitt overbevisende bevis at det kan også lett brukes for andre vev-basert prøver.
Introduction
Fremme innen Proteomikk, integrert og uovertruffen data samling makt som tillater, revolusjonert sterkt vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende visse sykdom forhold så vel som reflekterer den fysiologisk tilstand hos en bestemt celle befolkningen eller vev1,2,3,4. Proteomikk har også vist seg for å være en viktig plattform i ophthalmica forskning følsomhet og objektiv analyse av forskjellige okulær prøver som lettere identifikasjon av potensielle sykdom markører for eventuell diagnose og prognose, som dokumentert elegant av mange studier de siste årene, inkludert noen av oss1,5,6,7,8,9,10. Men er det ofte vanskelig å få menneskelige prøver for proteomic analyser av etiske grunner, spesielt med tanke på behovet for kontroll materiale fra friske individer for pålitelig sammenlignende analyser. På den annen side, er det også vanskelig å skaffe tilstrekkelig mengde prøver for optimal og pålitelig masse spectrometric analyser. Dette er spesielt viktig for masse-begrenset biologiske materialer som mikro-blodkar i øyet. En slik stor retrobulbar blod fartøy som spiller viktige roller i regulering av okulære blodstrøm er kort bakre ciliary arterien (sPCA). Forstyrrelsene eventuelle uregelmessigheter i denne vaskulær seng kan resultere i alvorlig klinisk konsekvenser, som kan føre til patogenesen av flere sight-truende sykdommer som grønn stær og nonarteritic fremre iskemiske fiberoptisk nevropati (NAION)11 , 12. men det er en mangel på studier Klargjørende proteom endringene i denne arteriell sengen på grunn av ovennevnte ulempene. Derfor de siste årene, hus svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har dukket opp som en god dyremodell ophthalmica forskning på grunn av høy morfologiske og Fylogenetiske likhetene mellom mennesker og griser13, 14,15. Svin okulær prøvene er lett tilgjengelig og viktigst er mer nøyaktig gjengivelse av menneskelig vev.
Vurderer den viktige rollen blodkar i øyet, samt mangel på metodikk hensyn til effektiv protein utvinning og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere preget proteom av svin sPCA med en protokoll som resulterte i identifikasjon av mange proteiner16. Basert på denne studien, har vi ytterligere optimalisert og beskrev grundig vår metode i denne artikkelen, som lar proteom analyse fra minutt mengder prøver ved svin sPCA som modell vev. Selv om Hovedformålet med denne studien var å etablere en MS-kompatibel metode for masse-begrenset okulær blodårene, har vi gitt betydelige eksperimentelle bevis at beskrevet arbeidsflyten kan også være bredt brukt til forskjellige vev-basert prøver.
Det er tenkt at denne arbeidsflyten vil være instrumentell for utarbeidelse av høy kvalitet MS-kompatible prøver fra små mengder materialer for omfattende proteomanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omfattende proteom profilering av en rekke ulike okulær prøver er et viktig og uunnværlig første skritt å belyse den molekylære mekanismer og signalnettverk trasé innblandet i helse og sykdom. For å oppnå høy kvalitet dataene og sikre reproduserbarhet av resultatene fra disse analysene, foregående eksempel forberedelsene er avgjørende, som fremhevet i en gjennomgang av Mandal et al. som diskuteres grundig eksempel behandling prosedyrer ansette todimensjonal gel gelelektroforese og massespektrometri strategi<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam støttes av den interne University forskningsmidler (Stufe 1) fra Universitetet medisinske sentrum av Johannes Gutenberg University Mainz og stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
