Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular
Summary
Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.
Abstract
O uso isolado ocular vasos sanguíneos in vitro para decifrar o estado fisiopatológico do olho usando abordagens tecnológicas avançadas expandiu-se enormemente nossa compreensão de certas doenças. Espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics surgiu como uma ferramenta poderosa para desvendar as alterações nos mecanismos moleculares e proteínas de sinalização de percursos nas camas vasculares na saúde e na doença. No entanto, etapas de preparação de amostra antes MS análises são cruciais para obter resultados reprodutíveis e elucidação em profundidade o complexo proteome. Isto é particularmente importante para a preparação de microvessels ocular, onde a quantidade de amostra disponível para análise é muitas vezes limitada e assim, representa um desafio para a extração de proteína ideal. Este artigo visa fornecer um protocolo eficiente, rápido e robusto para a preparação da amostra de um leito vascular ocular retrobulbar exemplar empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares. O presente método concentra-se nos procedimentos de extração da proteína do sobrenadante e sedimento da amostra após a homogeneização, limpeza com dispositivos de filtro centrífugo antes unidimensional gel de eletroforese e peptídeo purificação da amostra passos para a quantificação de rótulo livre num sistema MS Orbitrap-ion trap linear-ionização electrospray-cromatografia líquida. Embora este método foi desenvolvido especificamente para proteomics análises de microvessels ocular, nós também fornecemos evidências convincentes de que pode também ser facilmente empregado para outras amostras de tecido com base em.
Introduction
O avanço no campo da proteômica, quais licenças integrado e insuperável poder de coleta de dados, extremamente tem revolucionado nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a certas condições de doença, bem como refletindo o estado fisiológico de uma célula específica população ou tecido1,2,3,4. Proteomics também provou para ser uma plataforma importante na pesquisa oftálmica devido a sensibilidade e a análise imparcial das diferentes amostras oculares que facilitou a identificação de potenciais marcadores de doença para eventual diagnóstico e prognóstico, como evidenciado elegantemente por muitos estudos nos últimos anos, incluindo alguns dos nossos1,5,6,7,8,9,10. No entanto, muitas vezes é difícil obter amostras humanas para análises de proteomic devido a razões éticas, especialmente considerando a necessidade de material de controle de indivíduos saudáveis para as análises comparativas confiáveis. Por outro lado, é também um desafio para obter a quantidade suficiente de amostras para análises de espectrometria de massa ideais e confiáveis. Isto é particularmente crucial para massa-limitada materiais biológicos como os microvasos do olho. Um tal vaso sanguíneo retrobulbar grandes que tem um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo ocular é a artéria ciliar posterior curta (sPCA). Qualquer perturbação ou anomalias nesta cama vascular podem resultar em graves repercussões clínicas, que podem levar à patogênese de várias doenças fatais vista como glaucoma e nonarteritic neuropatia óptica isquêmica anterior (NAION)11 , 12. no entanto, há uma falta de estudos para elucidar as mudanças proteome nesta cama arterial devido as desvantagens acima mencionadas. Portanto, nos últimos anos, os suínos de casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) emergiu como um bom modelo de animais na pesquisa oftálmica devido as altas semelhanças morfológicas e filogenéticas entre os seres humanos e suínos13, 14,15. Porcinos amostras oculares estão facilmente disponíveis e mais importante, são uma representação mais precisa de tecidos humanos.
Considerando o importante papel destes vasos sanguíneos nos olhos, bem como a escassez de metodologia servida para extração de proteínas eficiente e análises destes microvessels, nós anteriormente têm caracterizado a proteoma da sPCA suínos usando um in-house protocolo que resultou na identificação de um número elevado de proteínas16. Com base neste estudo, temos ainda mais otimizado e descrito em profundidade nossa metodologia neste artigo, o que permite a análise do proteoma de quantidades minuciosas de amostras usando o sPCA porcina como tecido de modelo. Embora o objetivo principal deste estudo foi estabelecer uma metodologia compatível com o MS para os vasos sanguíneos oculares de massa limitada, nós fornecemos substanciais evidências experimentais que o fluxo de trabalho descrito também pode ser amplamente aplicado a várias amostras de tecido-baseado.
Prevê-se que este fluxo de trabalho será fundamental para a preparação de amostras de alta qualidade compatível com o MS de pequenas quantidades de materiais para análises de proteome abrangente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteome abrangente de perfil de uma variada gama de amostras oculares é um primeiro passo importante e indispensável para elucidar os mecanismos moleculares e vias de sinalização implicadas na saúde e na doença. Para obter dados de alta qualidade e garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir dessas análises, as etapas de preparação de amostra anterior são cruciais, como destacado em uma revisão por Matos et al. que discutiu em profundidade os procedimentos de processamento de amostra para dif…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam é suportado pelo interno Universidade pesquisa financiamento (1 Stufe) do centro médico de Universidade de o Mainz de Universidade Johannes Gutenberg e uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
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