Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama
Summary
Proteom karakterizasyonu oküler mikrovasküler yatak birçok oküler patolojiler insanlarda derinlemesine anlayış için çok önemli. Bu çalışmada protein çıkarma ve küçük kan damarlarının kütle spektrometresi esaslı proteomik analizleri kapları modeli olarak domuz kısa arka silier arterler istihdam üzerinden numune hazırlama için etkili, hızlı ve güçlü bir yöntem gösterir.
Abstract
İzole oküler kan damarları gelişmiş teknolojik yaklaşımlar kullanarak göz patofizyolojik durumunu çözmek için tüp bebek kullanımını büyük ölçüde bazı hastalıklar anlayışımızı genişletti. Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı proteomik moleküler mekanizmaları ve sağlık ve hastalık damar yataklarında yollar sinyal protein çözmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, örnek hazırlık adımları önce MS analizleri tekrarlanabilir sonuçlar ve karmaşık Proteom derinlemesine aydınlatma elde etmek büyük önem taşımaktadır. Bu nerede örnek analizler için kullanılabilir miktarı genellikle sınırlıdır ve böylece, en iyi protein çıkarılması için bir meydan okuma teşkil oküler yüzdeki hazırlanması için özellikle önemlidir. Verimli, hızlı ve güçlü bir iletişim kuralı için numune hazırlama domuz kısa arka silier arterler istihdam bir örnek retrobulbar oküler vasküler yatağın üzerinden sağlamak bu makalede çabaları. Mevcut yöntem odak üstünde protein çıkarma yordamları hem süpernatant ve Pelet Homojenizasyon, aşağıdaki örnek örnek santrifüj filtre cihazları tek boyutlu Jel Elektroforez ve peptid arıtma öncesi temizlik etiket içermeyen miktar sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma doğrusal iyon kapanı-Orbitrap MS sistemindeki adımları. Her ne kadar bu yöntem özellikle proteomik analizlerini oküler yüzdeki için geliştirilmiştir, biz de o da kolayca diğer doku tabanlı örnekleri için istihdam edilebilir ki inandırıcı kanıt sağladı.
Introduction
Hangi izni entegre ve eşsiz veri koleksiyon güç, proteomik, ilerlemesi alanında büyük ölçüde bizim anlayışı yansıtan olduğu gibi de bazı hastalık şartları altında yatan moleküler mekanizmaları devrim yarattı fizyolojik devlet bir belirli hücre nüfus veya doku1,2,3,4. Proteomik da duyarlılık ve tarafsız analiz için nihai tanı ve prognoz, potansiyel hastalık işaretleri tanımlaması olarak kolaylaştırdı farklı oküler örnekleri sayesinde oftalmik araştırma önemli bir platform olduğunu kanıtlamıştır zarif tarafından birçok çalışma bazı bizim dahil olmak üzere son yıllarda1,5,6,7,8,9,10göstermiştir. Ancak, proteomik analizleri etik nedenlerle, özellikle güvenilir karşılaştırmalı analizler için sağlıklı bireyler üzerinden kontrol malzemesi ihtiyacını göz önünde bulundurarak insan örneklerini almak genellikle zordur. Öte yandan, örnekleri en uygun ve güvenilir kitle spektrometrik analiz için yeterli miktarda elde etmek zordur. Bu mikro-kan damarları göz gibi kitle-sınırlı biyolojik malzemeler için özellikle önemlidir. Bir tür büyük retrobulbar oküler kan akımı yönetmelikte önemli roller oynayan damar kısa arka silier arter (sPCA) olduğunu. Herhangi bir pertürbasyon veya vasküler bu yatakta anomaliler glokom ve nonarteritic anterior iskemik optik nöropati (NAION)11 gibi birkaç görüş tehdit eden hastalıkların patogenezinde yol açabilir ciddi klinik yansımaları neden olabilir , 12. ancak, yukarıda belirtilen sakıncaları nedeniyle bu Arteryel yatakta Proteom değişiklikler elucidating çalışmalar eksikliği yoktur. Bu nedenle, son yıllarda ev domuz (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) iyi bir hayvan modeli olarak insanlar ve domuzlar13arasındaki yüksek morfolojik ve filogenetik benzerlikleri nedeniyle oftalmik araştırmalarda ortaya çıkmıştır, 14,15. Domuz oküler örnekleri are kolayca elde edilebilir ve en önemlisi, insan dokulara daha doğru bir şekilde temsil vardır.
Gözde bu kan damarlarının önemli rol, hem de göz önüne alındığında bu yüzdeki verimli protein çıkarma ve analizler için yiyecek ve içecek metodoloji eksiklik, biz daha önce bir in-house kullanarak domuz sPCA Proteom nitelendirmiştir proteinler16yüksek sayıda kimlik sonuçlanan iletişim kuralı. Bu çalışmaya dayanarak, biz daha fazla en iyi duruma getirilmiş ve derinlemesine açıklanan metodolojimiz bu makalede, domuz sPCA modeli doku kullanarak örnekleri dakika tutarlardan Proteom analiz sağlar. Bu çalışmanın temel amacı kitle-sınırlı oküler kan damarları için MS-uyumlu metodoloji kurmak oldu gerçi biz açıklanan iş akışı da geniş çeşitli doku tabanlı örnekleri için uygulanabilir olduğunu önemli deneysel kanıtlar sağladı.
Bu iş akışı enstrümantal kapsamlı Proteom analizleri için malzemelerin az miktarda yüksek kaliteli MS uyumlu örnekleri hazırlanması için öngörülen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kapsamlı Proteom oküler örnekleri çeşitli bir yelpazede profil oluşturma moleküler mekanizmaları ve sağlık ve hastalık karıştığı sinyal yolları aydınlatmak için bir önemli ve vazgeçilmez ilk adımı oluşturur. Yüksek kalite verilerini elde etmek için ve bu analizler elde edilen sonuçlar tekrarlanabilirlik emin olmak için yukarıdaki örnek hazırlık adımları çok önemli, vurgulanmış olarak bir inceleme tarafından mandalina ve ark. derinlemesine ele örnek işleme yordamları göz farklı …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Manicam iç Üniversitesi Araştırma Fonu (Stufe 1) Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1) hibe ve Johannes Gutenberg Üniversitesi Mainz Üniversitesi Tıp merkezinden tarafından desteklenmektedir.
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
