Här presenterar vi ett protokoll för sekventiell riktade kvantifiering och icke-riktad analys av fluorerade föreningar i vatten av masspektrometri. Denna metod ger kvantitativa nivåer av kända fluorochemical föreningar och identifierar okända kemikalier i relaterade prover med semi kvantitativa uppskattningar av sitt överflöd.
Historiska och framväxande per- och polyfluoroalkyl ämnen (PFASs) har rönt stort intresse från de allmänheten och myndigheterna från lokal till federala nivåer. Den fortsatta utvecklingen av PFSS kemier utmaning en till den miljöövervakning, där pågående utveckling av riktade metoder nödvändigtvis släpar upptäckten av nya kemiska föreningar. Det finns ett behov, därför att ha framåtblickande metoder som kan upptäcka nya och oväntade föreningar, övervaka dessa arter över tiden och lösa Detaljer för deras kemiska strukturen för att möjliggöra framtida arbete i människors hälsa. För detta ändamål icke öronmärkt analys av högupplösande masspektrometri erbjuder en bred bas upptäckt förhållningssätt som kan kombineras med nästan någon stickprovsundersökning för förberedelse och ger betydande kapacitet för sammansatta identifiering efter upptäckt. Häri, vi beskriver en fasta fasen extraktion (SPE) baserat urval koncentration metod anpassad för kortare kedja och mer hydrofil PFSS kemiska sammansättningar, såsom per fluorerade eter syror och perfluoroktansulfonat, och beskriver analys av prover som tillagas på detta sätt i både riktade och icke öronmärkt lägen. Riktade metoder ger överlägsen kvantifiering när referensstandarder finns men är egensäkra begränsade till förväntade föreningar när du utför analys. Däremot kan en icke-riktad strategi identifiera förekomsten av oväntade föreningar och ge viss information om deras kemiska struktur. Information om kemiska funktioner kan användas för att korrelera föreningar över provet platser och spåra överflöd och förekomst över tid.
Klassen för per- och polyfluoroalkyl ämnen (PFASs) är långlivade organiska föroreningar med betydande folkhälsoproblem. De specifika föreningar perfluoroktansyra syra (PFOA) och perfluorooctanesulfonate (PFOS) har dricksvatten hälsa rådgivande nivåer av EPA1,2 och deras stora amerikanska produktionen upphörde i 2000-talet3,4 . För att få en betydande förståelse för egenskaperna för PFSS har material i textil- och konsumenten produkten tillverkning sfärer, hundratals, om inte tusentals, alternativa PFSS kemier utvecklats för att fylla produktnischer, inklusive ersättare för den föråldrade föreningar5,6,7,8. Det finns en pågående behöver övervaka de miljömässiga nivåerna av rak kedja perfluorerade karboxylsyror och sulfonates sådan PFOS, PFOA och deras relaterade homologa serier, men nya kemiska föreningar omfattas inte av etablerade metoder såsom EPA Metoden 5379 och ofta saknar analytiska standarder för traditionella riktad analys. Avsikten med detta protokoll är således två gånger. Det ger en väg för den riktade LC-MS/MS-analysen av fluorochemical arter i vatten där det finns analytiska standarder och detaljer en sömlös integrering av en icke öronmärkt, högupplösta mass spectrometry-baserade strategi för dataanalys som gör det möjligt för detektion av okänd eller oväntade föreningar i samma prover.
Fasta fasen extraktion (SPE) är en etablerad teknik för provet sanering och koncentration med tillämpningar inom många analyter och prov matriser10,11. För PFSS analys, flera solid glans faser inklusive icke-polära, functionalized polar och jonbyte kolumner har använts i olika utsträckning för underklasser av fluorerade arter i en mängd olika matriser9,12, 13,14,15,16. Framsteg inom SPE provanalys använda on-line uppställningar kraftigt öka genomströmningen av strategi och förbättra reproducerbarheten för provhantering, men den grundläggande processen förblir konsekvent17. Vissa ansträngningar för att ta bort offline koncentrationen av SPE med stor volym injektioner har också genomförts, men dessa kräver ändringar i kromatografi att placerar dem utanför sfären av casual analys18,19 . Vår provanalys använder en polymera svag anjon exchange (vax) glans fas att noggrant skilja sura PFSS material från de traditionella organiska föroreningarna samtidigt uppnå betydande provets koncentration faktorer. Detta vax fas är viktigt att fånga kort kedja perfluorerade syror såsom perfluorobutane sulfonat (PFBS) eller perfluorerade etrar såsom hexafluoropropylene oxid dimer syra (HFPO-DA) som är mer polära än den längre kedja äldre perfluorerade arter20,21. Som det har skett en betydande förskjutning mot kortare fluorerade kedjor och eter integration i senaste PFSS kemi5, möjliggör denna fas urval grundligare återvinning av nya föreningar för MS analys.
Riktade LC-MS/MS kvantitering autentiserade standarder och stabil isotop märkt interna standarder ger en oöverträffad nivå av specificitet och känslighet för kvantitativ analys. Medan detta tillvägagångssätt är önskvärt i många situationer, är det opraktiskt för all alltför vanliga situationer i analysen. Målinriktade strategier fungerar endast för arter som förväntas i provet, och för vilka metoder har tidigare fastställts. För nya och framväxande föreningar, detta tillvägagångssätt är oförmögen att ens upptäcka arter som kan vara av intresse, oavsett deras kemi eller koncentration, och lågupplösta masspektrometrar är nästan oförmögna att tillhandahålla tillräcklig information för att entydig kemisk tilldelningar av okänd föreningar. Följaktligen, fältet av icke-riktad analys har uppstått, utnyttja kraften hos högupplösta moderna masspektrometrar att analysera prover utan en förutfattade hypotes och retroaktivt tilldela kemikalier till påvisbara funktioner i provet. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning inom områdena biologi22,23,24 och miljövetenskap25,26,27 på många klasser av kemikalier. Perfluorerade ämnen är särskilt enkla att identifiera i denna metod på grund av deras unika massa spektrala mönster och hundratals föreningar har beskrivits i bara tidigare några år5,28.
Det protokoll som diskuteras här är avsedd att anpassa riktade LC-MS/MS PFSS kvantitering med behovet av att identifiera och övervaka semi kvantitativt framväxande föreningar av intresse. Fasen SPE urval och provberedningstekniker är avsedda att säkerställa tillfångatagandet av mer hydrofil framväxande PFSS syror från vatten och kan vara mindre lämpade för längre kedja polymera arter och icke-joniska arter. Ytterligare, de data som genereras av icke-riktad analys är tät och av hög dimensionalitet, som kräver användning av data analysprogram. Sådan programvarupaket är ofta leverantörsspecifik och kräver modifiering för att fungera mellan instrumentet plattformar. Om möjligt analysprocessen har beskrivits på ett generiskt sätt och öppen källkod/freeware alternativ refereras, men effektiviteten och precisionen av någon programvara strategi måste bedömas på individuell basis.
Provhantering och förberedelse
Införandet av referens/spike standarder är av största vikt att alla riktade analyser, eftersom de ger en backspärr för att kontrollera analytiska giltighet. Avsaknaden av QC prov hindrar bedömningen av noggrannheten i resultaten. allestädes närvarande innebär fluorochemicals att chansen kontaminering av fältprov, bearbeta material eller LC-MS-systemet är inte ovanligt och måste redovisas. Ytterligare, det möjliggör validering av protokollet oavsett variation i dagliga provet behandling, eftersom många av stegen kan vara mycket varierande, särskilt SPE och provets koncentration steg. Utvinning av både äldre och nya perfluorerade ämnen kan påverkas kraftigt av valet av stationära fasen för koncentration och komponenter av källa proverna, såsom pH och salthalt46. Påverkan av prov förhållanden bör övervägas om särskilda grupper av pefluorinated kemikalier är av intresse. Alternativa förberedelser stickprovsundersökningar för vatten extrakt kan användas om laboratoriet setup är tillgänglig och nedströms dataanalysen återstår liknande.
Riktade dataanalys
För föreningar med tillgängliga standarder och matchade, stabil isotop märkt interna standarder, den primära oro för dataanalys är instrumental och bestämning av metoden detektionsgränser och lämplig rapportering spänner kan fastställas på ett laboratorium-av-laboratoriet grund använda standardmetoder, såsom signal-brus-förhållande från lågaktivt standard spikar47. Fel från inkompatibla matriseffekter kan uppstå i avsaknad av matchade interna standarder och korrekt rygg-prognos av spetsiga prover kan användas för att bedöma riktigheten av mätningarna. När det saknas standarder för att förbereda en kurva, en kvantitativ uppskattning av en okänd kan göras genom att behandla det identiskt med noggrant matchade standard förening, men fel i uppskattningen är storleksordningen 10 + gånger med begränsad förmåga att kvantifiera osäkerheten, se McCord, Newton och Strynar21. I dessa fall trenddata kan fortfarande samlas, men koncentrationen uppskattningar är till sin natur otillförlitliga.
Icke-riktad dataanalys
Topp plocka inställningar har en betydande inverkan på antalet kemiska funktioner identifieras, men kvaliteten på funktionsurval påverkas också kraftigt. Intresse i topp plocka beslut är 1) intensitet av enskilda massorna som ska inkluderas i spectra, ion överflöd tröskelvärdet 2) intensiteten av extraherade kromatogram toppar anses vara funktioner, funktionen överflöd tröskelvärdet 3) funktionen upptäckt frekvens, replikerar tröskeln och 4) analytiska variationen, CV tröskeln (figur 10).
Ställa in orealistiskt låga trösklar för peak plockning resultat i en exponentiell ökning i provet tid att lösa ytterligare funktioner i allt låg överflöd (tabell 7). Ion-överflöd tröskel filtren massa spektrala funktioner där nog av de enskilda isotopen sammansättning inte passera tröskeln. Detta väljer helst endast för funktioner med kvalitet MS spectra, säkerställa de är riktiga kemiska egenskaper i stället för instrumental buller och möjliggör formeln prognos i nedströms behandling. En lämplig tröskel är baserad på instrumental buller, helst åtminstone 3 x buller tröskeln för MS1 file. Tröskelvärdet för funktionen överflöd filtrerar kemiska funktioner baserat på intensiteten eller område av funktionen kromatografiska extraheras. Detta steg gör det möjligt för förkastande av låg överflöd toppar, som vanligtvis dålig kromatografiska kvalitet, har hög varianser, eller är resultatet av andra dålig programvara extraktion. En lämplig tröskel måste bestämmas per experiment, och matrisen baserat på en acceptabel nivå av dålig funktion generation (t.ex. funktioner under tröskelvärdet utställning oacceptabelt dålig kromatografi). Ytterligare kan analytiska QC används för att avvisa funktioner på kromatografisk baserat på inkonsekvent identifiering i analytisk eller förberedande replikat (replikera tröskel) eller baserat på dålig reproducerbarhet hela replikat (CV tröskel). Lämpliga nivåer beror på kvaliteten på den topp integration programvara som används och de kemiska enheterna under utredning. Lätt optimerad integrering protokollen och vattenlösliga perfluorföreningar funktioner bör identifieras i 80 + % av analytiska replikerar och CVs förväntas sjunka under 30%, som beskrivs i avsnittet metoder.
Topparna upptäckt från icke-riktad analys ger inte kvantitativa uppskattningar av koncentrationerna av material upptäcks. Ytterligare, sanna okända identitet kan vara svårt att bekräfta eftersom nya föreningar är frånvarande från allmänt tillgängliga databaser. Romanen strukturella bestämning kräver omfattande analys med flera metoder och kräver expertis i både masspektrometri och kemi. Normalisera peak områdena kemiska funktioner kan dock ge semi kvantitativa uppskattningar av koncentrationerna av okända från kända arter21. Om man konsekvent provtagning och förberedelser, kan tid trendinformation för enskilda arter skapas för att övervaka förekomsten av en kemikalie i framtiden som svaret för en enskild art bör överensstämma spärr stora variationer i matrix21.
Den främsta fördelen med denna metod är töjbarhet av provet behandling att möjliggöra både riktade och nontargeted analys. Även riktad analys ger likvärdig eller bättre än kvantitativ information, saknar den kraftigt bredd analys önskas när det gäller nya och framväxande material, samt deras förhållande till matris material. Tillämpa en målinriktad metod, eller ens misstänkt screening metod enbart utifrån kända material och begränsad databaser är helt blind för tidigare obemärkt arter, även om de kan ha signifikanta hälsoeffekter. Som förbättrar och databaser bli mer robust, kommer att riktigheten av okänd identifiering fortsätta att öka, med en samtidig minskning av investering i tid och nivå av expertis som krävs för att analysera den flerdimensionella data som genereras av detta tillvägagångssätt. Data som genereras för närvarande är dock betydande framtida värde eftersom data bank tillåter för post-hoc analys med nyutvecklade programvaran och möjliggör jämförelse över tid även om identiteten hos en upptäckta förening är för närvarande okänd.
The authors have nothing to disclose.
Det amerikanska Naturvårdsverket, genom dess kontor för forskning och utveckling, finansieras och förvaltas den forskning som beskrivs här. Detta dokument har granskats av US Environmental Protection Agency, kontor för forskning och utveckling, och godkänt för publicering. Åsikter som uttrycks i denna artikel är de av författarna och representerar inte nödvändigtvis åsikter eller politik av US Environmental Protection Agency. Denna forskning stöddes delvis av en avtalad tid till programmet postdoktoral forskning på nationella exponering forskningslaboratoriet administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning genom institutionsöverskridande avtal DW89992431601 mellan de US Department of Energy och U.S. Environmental Protection Agency.
Acqity ultra-high performance liquid chromatography system | Waters Corporation | Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low | |
Ammonium acetate | Fluka | 17836 | Mass spectrometry grade >99% pure |
Ammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Balance | Mettler | AB204S | |
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm | Waters Corporation | 186002350 | |
Dual piston syringe pump | Waters Corporation | SPC10-C | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | ARK2183 | |
Glass Microfiber Filters | Whatman | 1820-070 | |
High density polyethelye sample bottle | Nalgene | 2189-0032 | |
High Resolution Mass Spectrometer | Various | Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data. Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work | |
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Nitric Acid (35% w/w) | Thermo Fisher Scientific | SVCN-5-1 | Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water |
Polypropylene Buchner funnel | ACE Glass | 12557-09 | |
Polypropylene cenitrfuge tube and cap | BD Falcon | 352096 | |
Polypropylene Vacuum Flask (1 L) | Nalgene | DS4101-1000 | |
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer | Waters Corporation | Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis | |
Reagent Water | Any source determined to be PFAS free | ||
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
TurboVap nitrogen evaporator | Caliper Life Sciences | 103198 | Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead |
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) | Waters Corporation | 186003519 | |
Standard Solutions | |||
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) | Wellington | HFPO-DA | |
Additional targeted compound standards of interest | to be determined based on preliminary analysis and standard availability | ||
Mass labeled HFPO-DA | Wellington | M2HFPO-DA | |
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | PFAC-MXA | or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest |
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) | Wellington | MPFAC-MXA | or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs |
Software | |||
Mass Profiler Professional | Agilent | Or open source software packages | |
Profinder | Agilent | Or open source software packages |