Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta
Summary
O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.
Abstract
A natureza multitrófica dos estudos de expressão gênica de insetos herbívoros exige um grande número de repetições biológicas, criando a necessidade de protocolos herbívoros mais simples e simplificados. As perturbações dos insetos mastigatórios são geralmente estudadas em sistemas de plantas inteiras. Embora toda essa estratégia de organismo seja popular, não é necessário que observações semelhantes possam ser replicadas em uma única folha destacada. A suposição é que os elementos básicos exigidos para a transdução de sinal estão atuais dentro da folha própria. No caso de eventos precoces na transdução de sinal, as células precisam apenas receber o sinal da perturbação e transmitir esse sinal para as células vizinhas que são ensaiadas para a expressão gênica.
O método proposto simplesmente muda o tempo do destacamento. Em experimentos de plantas inteiras, as larvas são confinadas a uma única folha que é eventualmente separada da planta e ensaiada para a expressão gênica. Se a ordem da excisão é invertida, do último em estudos inteiros da planta, a primeiramente no estudo destacado, o experimento de alimentação é simplificado.
Solanum tuberosum var. Kennebec é propagado por transferência nodal em um meio de cultura simples do tecido e transferido ao solo para um crescimento mais adicional se desejado. As folhas são excisadas da planta-mãe e relocalizadas para placas de Petri onde o ensaio de alimentação é conduzido com os estágios larvares de M. sexta. O tecido foliar danificado é analisado para a expressão de eventos relativamente precoces na transdução de sinal. A análise da expressão gênica identificou fatores de transcrição Cys2-His2 (C2H2) específicos da infestação, confirmando o sucesso do uso de folhas destacadas em estudos de resposta precoce. O método é mais fácil de executar do que as infestações inteiras da planta e usa menos espaço.
Introduction
Herbívoros define em movimento uma série de eventos moleculares durante os quais uma planta pode identificar o ataque e montar uma resposta adequada para a sua sobrevivência. Uma planta recebe duas pistas básicas de insetos mastigadores; um dos danos físicos ao tecido e o outro a partir de substâncias específicas de insetos. Os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) são liberados em resposta a danos criados por bocais larvares e desencadeiam uma resposta de ferida bem definida que resulta em um aumento no ácido jasmonico hormonal e na transcrição dos genes de defesa1. Um dos Damps mais conhecidos é systemin, um polipeptídeo que é formado pela clivagem da proteína prosystemin maior depois que uma folha é ferida2,3. A resposta da ferida do ácido jasmônico é modulada mais por testes padrões moleculars-associados HERBIVORE (hamps), que podem ser derivados da saliva da lagarta, dos índices do intestino (regurgitant) e das fezes (Frass)4. Os insetos usam essas substâncias para impulsionar ou evadir a resposta de defesa5. Os fatores de transcrição então retransmitem a mensagem dos sinais hormonais na resposta de defesa via regulação dos genes de defesa a jusante6,7,8.
Alguns estudos de interação planta-inseto utilizados em configurações laboratoriais são do tipo simulado, com o objetivo de aproximar o método natural de alimentação pelo inseto. A herbívoria simulada é geralmente realizada através da criação de danos artificiais em tecidos vegetais com várias ferramentas que imitam o mecanismo específico de bocais de insetos suficientes para causar a liberação de DAMPs e desencadear a produção de genes de defesa. Outros componentes específicos do inseto, como secreções orais ou regurgitantes, são freqüentemente adicionados para replicar a contribuição de hamps9,10,11. A criação de um tamanho específico e tipo de ferida e a aplicação de quantidades precisas de HAMPs é uma vantagem para estes tipos de estudos e pode oferecer resultados mais reprodutíveis. Estudos herbívoros naturais, onde o dano ao tecido vegetal é realizado pela aplicação de insetos adquiridos em campo ou de laboratório, são muitas vezes mais desafiadores porque as quantidades de tamanho da ferida e do HAMP são governadas pelo comportamento de insetos e adicionam variabilidade ao Dados. Os métodos naturais versus simulados e suas vantagens e desvantagens são bem debatidos na literatura12,13,14.
Para estudar eventos de sinalização precoce, como fatores de transcrição, uma determinada porcentagem da folha deve ser consumida em um período de tempo relativamente curto, de modo que as larvas devem começar a mastigar imediatamente e manter o consumo até que a folha seja congelada para análise. M. sexta é um alimentador voraz em várias plantas solanáceas durante muitos de seus estágios larval, fazendo o ideal para transmitir dano máximo em uma quantidade relativamente curta de tempo15. Isso é conveniente ao estudar eventos de sinalização precoce, pois a resposta da planta ocorre quase que imediatamente após um inseto contata a superfície foliar16,17. O método comumente usado da gaiola do grampo da contenção prova desajeitado, porque as gaiolas múltiplas exigiriam ajustes contínuos durante todo a experimentação para permitir a remoção ou a adição de larvas. As folhas devem igualmente ser grandes bastante e forte bastante suportar os insetos múltiplos que alimentam ao mesmo tempo. Estes tipos de plantas de batata exigem uma grande quantidade de espaço para observar a alimentação. As larvas frequentemente se realocarão para a parte inferior da superfície foliar, o que também torna as observações de alimentação bastante difíceis. Usar plantas inteiras para executar estes experimentos é claramente complicado.
O estudo atual usa folhas destacadas isoladas em placas de Petri um pouco do que plantas inteiras para simplificar e simplificar a aproximação inteira da planta a estudar o herbivory. A aplicação do protocolo neste estudo limita-se à observação de um grupo de C2H2 fatores de transcrição induzidos precocemente em folhas de batata após lesão herbívora por larvas de M. sexta .
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de metodologias herbívórias de plantas inteiras existentes é desnecessário para atingir o objetivo deste estudo em particular (ou seja, um conjunto de genes candidatos para sua resposta à infestação). O benefício óbvio do refinamento desanexado da folha é encurtar o tempo que toma para executar ensaios herbivoria. A natureza pesado de plantas inteiras com gaiolas do grampo é eliminada e os ensaios são executados mais logo, desde que as plantas tão novas quanto 2 semanas podem ser usadas para colher fol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Bob Farrar e Alexis Park por fornecer insetos usados neste estudo e por sua expertise em estadiamento larval. Agradecimentos adicionais a Michael Blackburn e Saikat Ghosh para a revisão crítica do manuscrito.
Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é unicamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura dos EUA.
USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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