एक मसूर का सीधा इंजेक्शन वेक्टर चूहे रीढ़ की हड्डी में कई मोटर रास्ते पर प्रकाश डाला गया
Summary
यह प्रोटोकॉल एक retrogradely परिवहनीय वायरल वेक्टर का चूहा रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में इंजेक्शन को दर्शाता है । सदिश को synapse पर ले जाया जाता है और लक्ष्य न्यूरॉन्स के सेल शरीर में पहुँचाया जाता है । इस मॉडल महत्वपूर्ण रीढ़ की पगडंडियां या जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए लक्ष्यीकरण कोशिकाओं के प्रतिगामी अनुरेखण के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
तंत्रिका तंत्र में कोशिकाओं में ब्याज के प्रोटीन का परिचय सहज जैविक बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है कि सबसे अणुओं के लिए उपयोग की सीमा । रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में सीधे इंजेक्शन इन बाधाओं को नजरअंदाज, सेल निकायों या synapses जहां अणुओं को शामिल किया जा सकता है के लिए पहुंच प्रदान । इस विधि के साथ वायरल वेक्टर प्रौद्योगिकी के संयोजन जीन थेरेपी या पथ ट्रेसिंग के उद्देश्य के लिए तंत्रिका ऊतक में लक्ष्य जीन की शुरुआत के लिए अनुमति देता है । यहां एक वायरस अत्यधिक कुशल प्रतिगामी परिवहन (HiRet) के लिए इंजीनियर proprioस्पाइनल interneurons (PNs) के synapses पर शुरू की रीढ़ की हड्डी और ब्रेंहेम नाभिक में ंयूरॉंस के लिए विशिष्ट परिवहन को प्रोत्साहित करने के लिए । लक्ष्यीकरण PNs कई कनेक्शन वे ऐसे rubroस्पाइनल और रेटिकुलोस्पाइनल ट्रैक्ट के रूप में मोटर रास्ते से प्राप्त का लाभ लेता है, साथ ही रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों भर में एक दूसरे के साथ उनके परस्पर संबंध । प्रतिनिधि का उपयोग कर के साथ HiRet वेक्टर का प्रयोग कर संवैधानिकता से सक्रिय हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सेल निकायों के उच्च निष्ठा विवरण, वक्ष PNs में axons और डेन्ड्रोटिक arbors से पता चलता है और पोन्टाइन में रेटिकुलोस्पाइनल ंयूरॉंस के गठन में । HiRet ब्रेंहेम रास्ते और PNs में अच्छी तरह से शामिल है, लेकिन corticospinal पथ ंयूरॉंस में उंर निर्भर एकीकरण से पता चलता है । सारांश में, वायरल वैक्टर का उपयोग रीढ़ की हड्डी इंजेक्शन लक्षित tracts के ंयूरॉंस में रुचि के प्रोटीन की शुरुआत के लिए एक उपयुक्त तरीका है ।
Introduction
वायरल वैक्टर महत्वपूर्ण जैविक उपकरण है कि कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री का परिचय करने के लिए दोषपूर्ण जीन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए कर सकते हैं, महत्वपूर्ण वृद्धि प्रोटीन या विनिर्माण मार्कर प्रोटीन है कि संरचना और synaptic कनेक्शन पर प्रकाश डाला अपने लक्ष्य । इस अनुच्छेद के एक अत्यधिक कुशल retrogradely परिवहनीय मसूरी वायरल वेक्टर के सीधे इंजेक्शन पर ध्यान केंद्रित करने में चूहा रीढ़ की हड्डी में फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग के साथ प्रमुख मोटर रास्ते को उजागर करने के लिए । इस विधि भी axonal पुनर्जनन और regrowth अध्ययन के लिए अत्यधिक उपयुक्त है ंयूरॉंस की विभिंन आबादी में रुचि के प्रोटीन परिचय और कार्यात्मक मानचित्रण अध्ययन1,2के लिए ंयूरॉंस मौन के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
रीढ़ की हड्डी के मोटर मार्ग के कई संरचनात्मक विवरण जैसे bda और fluoro-गोल्ड3,4,5,6,7 के रूप में शास्त्रीय tracers के साथ प्रत्यक्ष इंजेक्शन अध्ययन के माध्यम से आविर्भाव किया गया , 8. इन tracers सोने के मानक माना जाता है, लेकिन इस तरह के क्षतिग्रस्त axons द्वारा उत्साहित के रूप में कुछ नुकसान हो सकता है, या सफेद एक इंजेक्शन साइट आसपास के मामले में मार्ग में axons9,10,11 . यह मार्ग कनेक्टिविटी की गलत व्याख्याओं को जंम दे सकता है और पुनर्जनन अध्ययन में एक खामी है जहां क्षतिग्रस्त या विच्छेद axons द्वारा डाई अवशोषण बाद में12विश्लेषण के दौरान फाइबर regenerating के लिए गलत हो सकता है हो सकता है ।
वे स्थिर प्रदान करते हैं, के रूप में वे न्यूरोनल आबादी में दीर्घकालिक अभिव्यक्ति13,14,15,16,17,18 ,19. हालांकि, पारंपरिक रूप से पैक की गई मसूर की दाल में सीमित प्रतिगामी परिवहन हो सकता है और vivo4,20,21में इस्तेमाल होने पर इम्यून सिस्टम रिस्पांस ट्रिगर हो सकता है । एक उच्च कुशल प्रतिगामी परिवहन वेक्टर कहा जाता है काटो एट अल द्वारा उत्पादित किया गया है एक रेबीज वायरस ग्लाइकोप्रोटीन के साथ वायरल लिफाफा संशोधित करने के लिए एक संकर वेक्टर कि प्रतिगामी परिवहन में सुधार22,23बनाने के लिए ।
प्रतिगामी अनुरेखण एक लक्ष्य ंयूटन के synaptic अंतरिक्ष में एक सदिश परिचय, यह है कि कोशिका axon द्वारा लिया और सेल शरीर को ले जाया जा करने के लिए अनुमति दी । hiret के सफल परिवहन चूहों और रहनुमाओं23,24 और मोटर ंयूरॉंस में पेशी से22के दिमाग में न्यूरोनल synapses से प्रदर्शित किया गया है । यह प्रोटोकॉल काठ का रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को दर्शाता है, विशेष रूप से proprioस्पाइनल interneurons और ब्रेंहेम ंयूरॉंस के synaptic टर्मिनलों को लक्षित । PNs कई अलग रीढ़ की हड्डी से कनेक्शन प्राप्त करते है और इस प्रकार रीढ़ की हड्डी और ब्रेंटम में ंयूरॉंस की एक विविध जनसंख्या को लक्षित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस अध्ययन में लेबल ंयूरॉंस सर्किट innervating मोटर ंयूरॉंस पूल हिंदलिंब मोटर समारोह से संबंधित का प्रतिनिधित्व करते हैं । मजबूत लेबलिंग रीढ़ की हड्डी और ब्रेनहेम में देखा जाता है, जिसमें डेन्ट्रटिक अरबेर्स और axon टर्मिनलों के उच्च निष्ठा विवरण शामिल हैं । हम भी गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के भीतर पिछले अध्ययनों में इस विधि का इस्तेमाल किया है proprioस्पाइनल और ब्रेंहेम रेटिकुलोमेरु रास्ते25लेबल ।
यह प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर के एक चूहे की काठ की रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन को दर्शाता है । के रूप में 1 मूवी में देखा, चीरा पिछले रिब पर स्थित L1 कशेरुका की पहचान द्वारा लक्षित है । यह एक 3-4 सेमी चीरा कि L1-L4 रीढ़ की हड्डी पर मांसपेशियों को उजागर के लिए एक पुच्छ मील का पत्थर के रूप में प्रयोग किया जाता है । टी11-T13 कशेरुका के पृष्ठीय पहलुओं के Laminectomies प्रदर्शन कर रहे है और एक beveled कांच की सुई मिडलाइन से ०.८ mm पार्श्व का निर्देशन किया है और ग्रे मामले में गहरी १.५ mm कम करने के लिए वायरस सुई ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में ंयूरॉन्स के आनुवंशिक हेरफेर फ्लोरोसेंट ट्रेसिंग के माध्यम से संवेदी, मोटर और स्वायत्त रास्ते को उजागर करने के लिए और चोट के बाद न्यूरोनल ट्रैक्ट के regrowth क्षमता का पता लगान?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक R01 R01NS103481 के संस्थान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और बाल चिकित्सा अनुसंधान अनुदान SHC ८४०५१ और SHC ८६००० और रक्षा विभाग (SC140089) के लिए Shriners अस्पताल ।
Materials
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
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