Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging av Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe Sp. (Annelida), og Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
Her, protokoller for å utføre Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging av tre Marine virvelløse dyr er forklart i detalj. Denne studien beskriver trinn som prøve fiksering, farging, montering, skanning, rekonstruksjon av bilder og dataanalyser. Forslag til hvordan protokollen kan justeres for ulike prøver er også gitt.
Abstract
Tradisjonelt har biologer måttet stole på destruktive metoder som snitting for å undersøke de indre strukturene i ugjennomsiktige organismer. Ikke-destruktiv Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging har blitt en kraftig og voksende protokoll i biologi, på grunn av teknologiske fremskritt i prøven farging metoder og innovasjoner i microCT maskinvare, prosessering datamaskiner, og data analyseprogramvare. Imidlertid er denne protokollen ikke brukes ofte, som det er i de medisinske og industrielle felt. En av grunnene til denne begrensede bruken er mangelen på en enkel og forståelig Manual som dekker alle de nødvendige trinnene: sample samling, fiksering, farging, montering, skanning, og dataanalyser. En annen grunn er det store mangfoldet av Metazoer, spesielt Marine virvelløse dyr. På grunn av forskjellige størrelser, morfologier og physiologies i marine dyr er det avgjørende å justere eksperimentelle forhold og maskinvarekonfigurasjoner på hvert trinn, avhengig av prøven. Her er microCT Imaging metoder forklart i detalj ved hjelp av tre phylogenetically diverse Marine virvelløse dyr: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida), og Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Forslag opp på utføre microCT tenkelig opp på forskjellige dyrene er likeledes forsynt.
Introduction
Biologiske forskere har generelt måttet lage tynne seksjoner og utføre observasjoner av lys eller elektron mikroskopi for å undersøke de indre strukturene i ugjennomsiktige organismer. Disse metodene er imidlertid destruktive og problematiske når de brukes på sjeldne eller verdifulle prøver. Videre er flere trinn i metoden, for eksempel innebygging og snitting, tidkrevende, og det kan ta flere dager å observere en prøve, avhengig av protokollen. Videre, ved håndtering av en rekke seksjoner, er det alltid en mulighet for å skade eller miste noen seksjoner. Vev clearing teknikker er tilgjengelig for noen eksemplarer1,2,3,4,5 men er ennå ikke aktuelt for mange dyrearter.
For å overkomme disse problemene, noen biologer har begynt å bruke Microfocus X-ray beregnet tomografi (microCT) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I røntgen CT er prøven bestrålt med røntgenstråler fra ulike vinkler som genereres fra en røntgen kilde som beveger seg rundt prøven, og de overførte Røntgenbildene overvåkes av en detektor som også beveger seg rundt prøven. Data innhentet for røntgen overføring analyseres for å rekonstruere tverrsnitt bilder av prøven. Denne metoden gjør det mulig observasjon av interne strukturer uten ødeleggelse av prøven. På grunn av sin sikkerhet og letthet, det er ofte brukt i medisinsk og Dental applikasjoner, og CT-systemer kan bli funnet i sykehus og tannlege sentre over hele verden. I tillegg brukes industrielle røntgen CT ofte til å observere ikke-medisinske prøver for inspeksjon og metrologi i det industrielle feltet. I motsetning til medisinsk CT, der røntgen kilde og detektorer er mobile, de to delene er festet i industriell CT, med prøven roterende under skanning. Industriell CT produserer generelt høyere oppløselige bilder enn medisinsk CT og er referert til som microCT (mikrometer-oppløsning) eller nanoCT (nanometer-nivå oppløsning). Nylig forskning bruker microCT har raskt økt i ulike felt av biologi14,15,16,17,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , i 34.
Biologiske studier med CT i utgangspunktet målrettede interne strukturer som i hovedsak består av hardt vev, som bein. Fremskritt i farging teknikker ved hjelp av ulike kjemiske stoffer aktivert visualisering av bløtvev i ulike organismer6,7,8,9,14,15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33 for alle , 34. av disse reagensene, jod-baserte kontrastmidler er relativt trygt, billig, og kan brukes til visualisering av bløtvev i ulike organismer7,14. Om Marine virvelløse dyr, microCT har vært mye brukt på slike dyr sombløtdyr 6,25,32,33,annelids 18,19, 20 priser og , 28, og arthoropods21,23,29,31. Imidlertid, der ha blitt få meddeler opp på annet dyr disse bakteriene, som bryozoans6, xenacoelomorphs26, og Trichoplax24,30. Generelt har det vært færre studier med microCT på Marine virvelløse dyr enn de på virveldyr. En viktig årsak til denne begrensede bruken på Marine virvelløse dyr er det store mangfoldet observert i disse dyrene. På grunn av de ulike størrelsene, morfologier og physiologies, reagerer hver art forskjellig på ulike eksperimentelle prosedyrer. Derfor er det avgjørende under prøve utarbeidelse å velge den mest hensiktsmessige fiksering og farging reagens, og å sette forholdene på hvert trinn, justert for hver art. På samme måte er det også nødvendig å angi skanne konfigurasjoner, for eksempel monteringsmetode, spenning, strøm, mekanisk forstørrelses kurs, og plass oppløsnings strømmen, hensiktsmessig for hver prøve. For å løse dette problemet, en enkel og forståelig Manual som dekker alle de nødvendige skritt, forklarer hvordan hvert trinn kan justeres avhengig av prøven, og viser detaljerte eksempler fra flere prøver er viktig.
I denne studien beskriver vi microCT bilde protokoll trinn for trinn, fra prøve fiksering til dataanalyse, ved bruk av tre Marine virvelløse arter. Eksemplarer av havet Anemone Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) ble samlet i nærheten av Misaki Marine biologiske stasjon, Universitetet i Tokyo. De hadde en sfærisk, myk kropp som var ca 2 cm i diameter (figur 1a-C). Harmothoe Sp. (Polychaeta, Annelida) prøvene ble også samlet inn i nærheten Misaki Marine Biological Station. De var slanke ormer som var ca 1,5 cm i lengde, med tøffe chaetae tilstede langs hele kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prøven ble samlet inn i nærheten av Shimoda Marine Research Center, Universitetet i TSUKUBA, under 13Th JAMBIO Coastal organisme joint Survey. Det var en myk orm som var ca 0,8 cm i lengde (figur 1e). Justeringer som gjøres for betingelsene og konfigurasjonene i hvert utvalg er forklart i detalj. Vår studie gir flere forslag om hvordan du utfører microCT Imaging på Marine virvelløse dyr, og vi håper at det vil inspirere biologer til å utnytte denne protokollen for sin forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiksativene ved hjelp av formalin, for eksempel 10% (v/v) formalin løsning i sjøvann som brukes i denne studien, er kjent for å bevare morfologi av forskjellige Marine virvelløse dyr og brukes ofte for microCT Imaging18,24,25 ,26,28,30,33. Men restriksjoner på bruk av dette kjemiske ha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Toshihiko Shiroishi for hans assistanse og for å gi forskningsmiljøet i løpet av denne studien. Vi er takknemlige for Kensuke Yanagi og Takato Izumi for råd om A. equina, og Masaatsu Tanaka for råd om Harmothoe Sp. prøven. Vi vil gjerne takke de ansatte ved Shimoda Marine Research Center, Universitetet i Tsukuba, og Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo for deres hjelp i utvalget samlinger. Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk språk redigering. Dette arbeidet ble støttet av JSP Grant-in-Aid for unge forskere (A) (JP26711022) til HN, og JAMBIO, Japanese Association for marinbiologi.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
