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Environnement

Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Published: August 06, 2019
doi:
10.3791/59161
, , ,
1Mammalian Genetics Laboratory,National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station,The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center,University of Tsukuba

Summary

Aquí, los protocolos para realizar imágenes de tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) de tres animales invertebrados marinos se explican en detalle. Este estudio describe los pasos tales como la fijación de muestras, la tinción, el montaje, el escaneo, la reconstrucción de imágenes y los análisis de datos. También se proporcionan sugerencias sobre cómo se puede ajustar el protocolo para diferentes muestras.

Abstract

Tradicionalmente, los biólogos han tenido que depender de métodos destructivos como la sección para investigar las estructuras internas de los organismos opacos. La tomografía computarizada por rayos X de microfoco no destructivo (microCT) se ha convertido en un protocolo potente y emergente en biología, debido a los avances tecnológicos en los métodos de tinción de muestras e innovaciones en hardware de microCT, computadoras de procesamiento y datos software de análisis. Sin embargo, este protocolo no se utiliza comúnmente, como lo es en los campos médico e industrial. Una de las razones de este uso limitado es la falta de un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios: recolección de muestras, fijación, tinción, montaje, escaneo y análisis de datos. Otra razón es la gran diversidad de metazoos, particularmente invertebrados marinos. Debido a los diversos tamaños, morfologías y fisiologías de los invertebrados marinos, es crucial ajustar las condiciones experimentales y las configuraciones de hardware en cada paso, dependiendo de la muestra. Aquí, los métodos de imágenes microCT se explican en detalle utilizando tres invertebrados marinos filogenéticamente diversos: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). También se proporcionan sugerencias sobre la realización de imágenes microCT en varios animales.

Introduction

Los investigadores biológicos generalmente han tenido que hacer secciones delgadas y realizar observaciones por microscopía ligera o electrónica con el fin de investigar las estructuras internas de los organismos opacos. Sin embargo, estos métodos son destructivos y problemáticos cuando se aplican a especímenes raros o valiosos. Además, varios pasos en el método, como la incrustación y la sección, consumen mucho tiempo, y pueden tardar varios días en observar una muestra, dependiendo del protocolo. Además, al manipular numerosas secciones, siempre existe la posibilidad de dañar o perder algunas secciones. Las técnicas de limpieza de tejidos están disponibles para algunos especímenes1,2,3,4,5, pero todavía no son aplicables para muchas especies animales.

Para superar estos problemas, algunos biólogos han comenzado a utilizar la tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) imágenes6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. En la TC de rayos X, la muestra es irradiada con rayos X desde varios ángulos que se generan a partir de una fuente de rayos X que se mueve alrededor de la muestra, y los rayos X transmitidos son monitoreados por un detector que también se mueve alrededor de la muestra. Los datos de transmisión de rayos X obtenidos se analizan para reconstruir imágenes transversales de la muestra. Este método permite la observación de estructuras internas sin destrucción de la muestra. Debido a su seguridad y facilidad, se utiliza comúnmente en aplicaciones médicas y dentales, y los sistemas de TC se pueden encontrar en hospitales y centros dentales de todo el mundo. Además, la TC de rayos X industrial se utiliza con frecuencia para observar muestras no médicas para inspección y metrología en el campo industrial. A diferencia de la TC médica, en la que la fuente de rayos X y los detectores son móviles, las dos partes se fijan en TC industrial, con la muestra girando durante el escaneo. La TC industrial generalmente produce imágenes de mayor resolución que la TC médica y se conoce como microCT (resolución a nivel de micrométrico) o nanoCT (resolución a nivel de nanómetro). Recientemente, la investigación con microCT ha aumentado rápidamente en diversos campos de la biología14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.

Los estudios biológicos que utilizan CT inicialmente se dirigió a estructuras internas que consisten principalmente en tejido duro, como el hueso. Los avances en las técnicas de tinción utilizando diversos agentes químicos permitieron la visualización de tejidos blandos en diversos organismos6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. De estos reactivos, los agentes de contraste a base de yodo son relativamente seguros, baratos y se pueden utilizar para la visualización de tejidos blandos en diversos organismos7,14. En cuanto a los invertebrados marinos, la microCT hasido ampliamente utilizada en animales como los moluscos 6,25,32,33, anélidos18,19, 20 , 28, y arthorópodos21,23,29,31. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre otrasphyla animales, como bryozoans 6, xenacoelomorphs26,y cnidarios24,30. En general, se han realizado menos estudios con microCT en invertebrados marinos que en los vertebrados. Una de las principales razones de este uso limitado de los invertebrados marinos es la gran diversidad observada en estos animales. Debido a sus diversos tamaños, morfologías y fisiologías, cada especie reacciona de manera diferente a diferentes procedimientos experimentales. Por lo tanto, es crucial durante la preparación de la muestra elegir el reactivo de fijación y tinción más adecuado, y establecer las condiciones en cada paso, ajustado para cada especie. Del mismo modo, también es necesario establecer las configuraciones de escaneo, como el método de montaje, voltaje, corriente, velocidad de aumento mecánica y la potencia de resolución de espacio, adecuadamente para cada muestra. Para superar este problema, es esencial un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios, explica cómo se puede ajustar cada paso dependiendo de la muestra, y muestra ejemplos detallados de múltiples muestras.

En el presente estudio, describimos el protocolo de imágenes microCT paso a paso, desde la fijación de muestras hasta el análisis de datos, utilizando tres especies de invertebrados marinos. Los especímenes de la anémona de mar Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) fueron recogidos cerca de la Estación Biológica Marina misaki, Universidad de Tokio. Tenían un cuerpo esférico y suave de unos 2 cm de diámetro (Figura1A-C). También se recogieron muestras de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) cerca de la Estación Biológica Marina de Misaki. Eran gusanos delgados de unos 1,5 cm de longitud, con chaetas duras presentes a lo largo de todo el cuerpo (Figura1D). Un espécimen Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fue recolectado cerca del Centro de Investigación Marina Shimoda, Universidad de Tsukuba, durante el 13o Estudio Conjunto de Organismos Costeros de JAMBIO. Era un gusano de cuerpo suave que tenía aproximadamente 0,8 cm de longitud (Figura1E). Los ajustes realizados para las condiciones y configuraciones de cada muestra se explican en detalle. Nuestro estudio proporciona varias sugerencias sobre cómo realizar imágenes microCT en invertebrados marinos, y esperamos que inspire a los biólogos a utilizar este protocolo para su investigación.

Protocol

1. Fijación Para Actinia equina,relajar a los animales en 10% MgCl2 agua de mar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera al 70% de etanol y almacene a temperatura ambiente. Para Harmothoe sp., anestesiar a los animales colocándolos en agua de mar helada durante unos 15 minutos. Traslado a una solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar y almacenar a temperatura ambiente. Para Xenoturbella japonica,relaja al animal usando 7% M…

Representative Results

Realizamos imágenes microCT en A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) después de manchar las muestras con 25% de solución lugol. La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de los tejidos blandos internos (Figura6). Junto con informes anteriores6,7…

Discussion

Se sabe que los fijadores que utilizan formalina, como la solución de formalina del 10% (v/v) en el agua de mar utilizada en este estudio, preservan la morfología de diversos invertebrados marinos y se utilizan a menudo para imágenes microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Sin embargo, las restric…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Toshihiko Shiroishi por su ayuda y por proporcionar el entorno de investigación durante este estudio. Agradecemos a Kensuke Yanagi y Takato Izumi por el asesoramiento sobre A. equina,y Masaatsu Tanaka por consejos sobre el espécimen Harmothoe sp. Nos gustaría agradecer al personal del Centro de Investigación Marina de Shimoda, universidad de Tsukuba, y de la Estación Biológica Marina misaki, la Universidad de Tokio, por su ayuda en colecciones de muestras. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés. Este trabajo fue apoyado por la JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) a HN, y JAMBIO, Asociación Japonesa de Biología Marina.

Materials

250-ml Erlenmeyer flask Corning CLS430183
5-ml Sampling tube ST-500 BIO-BIK 103010
50-ml Polypropylene tube Greiner Bio One International 227261
60-mm Non-treated Dish IWAKI 1010-060
Agarose Promega V3125
Ecological grade tip (blue) 1000 µl BMBio BIO1000RF
Ethanol Wako Pure Chemical Industries 057-00451
Formalin Wako Pure Chemical Industries 061-00416
Iodine Wako Pure Chemical Industries 094-05421
Magnesium chloride hexahydrate Wako Pure Chemical Industries 135-00165
OsiriX DICOM Viewer Pixmeo SARL OsiriX MD v10.0 https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldehyde Wako Pure Chemical Industries 163-25983
Petiolate needle AS ONE 2-013-01
Pipetman P200 Micropipette GILSON F123601
Pipetman P1000 Micropipette GILSON F123602
Potassium iodide Wako Pure Chemical Industries 166-03971
Precision tweezers 5 DUMONT 0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul Sorenson 10660
Razor blades Feather FA-10
Ring tweezers NAPOX A-26
Stereoscopic microscope Leica MZ95
X-ray Micro-CT imaging system Comscantechno ScanXmate-E090S105
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References

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Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha). J. Vis. Exp. (150), e59161, doi:10.3791/59161 (2019).
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