Microfocus X-ray CT (microCT) avbildning av Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), och xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)
Summary
Här förklaras protokoll för att utföra mikrofokus röntgenbild behandling av tre Marina ryggradslösa djur i detalj. Denna studie beskriver steg som exempel fixering, färgning, montering, skanning, bild rekonstruktion, och dataanalyser. Förslag på hur protokollet kan justeras för olika prover tillhandahålls också.
Abstract
Traditionellt har biologer tvingats förlita sig på destruktiva metoder som snittning för att undersöka de inre strukturerna hos ogenomskinliga organismer. Icke-förstörande med röntgen datortomografi (MicroCT) Imaging har blivit ett kraftfullt och framväxande protokoll i biologi, på grund av tekniska framsteg i provet färgning metoder och innovationer i MicroCT hårdvara, bearbetning av datorer och data analysprogramvara. Detta protokoll används dock inte ofta, eftersom det är inom de medicinska och industriella områdena. En av anledningarna till denna begränsade användning är avsaknaden av en enkel och begriplig manual som täcker alla nödvändiga steg: provtagning, fixering, färgning, montering, skanning och dataanalyser. En annan orsak är den stora mångfalden av metazoaner, särskilt Marina ryggradslösa djur. På grund av Marina ryggradslösa djur olika storlekar, morfologier och fysiologier, är det viktigt att justera experimentella förhållanden och hårdvarukonfigurationer vid varje steg, beroende på provet. Här beskrivs microCT Imaging metoder i detalj med hjälp av tre fylogenetiskt olika Marina ryggradslösa djur: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida), och xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Förslag på hur man utför microCT Imaging på olika djur tillhandahålls också.
Introduction
Biologiska forskare har i allmänhet varit tvungna att göra tunna sektioner och utföra observationer av ljus eller elektronmikroskopi för att undersöka de inre strukturerna av ogenomskinliga organismer. Dessa metoder är dock destruktiva och problematiska när de appliceras på sällsynta eller värdefulla exemplar. Dessutom är flera steg i metoden, till exempel inbäddning och snittning, tidskrävande och det kan ta flera dagar att observera ett prov, beroende på protokollet. Dessutom, vid hantering av många sektioner, det finns alltid en möjlighet att skada eller förlora vissa sektioner. Vävnads röjnings tekniker finns tillgängliga för vissa exemplar1,2,3,4,5 men är ännu inte tillämpliga för många djurarter.
För att övervinna dessa problem, har vissa biologer börjat använda med röntgen datortomografi (MicroCT) Imaging6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. I röntgen CT är preparatet bestrålat med röntgenstrålar från olika vinklar som genereras från en röntgenkälla som rör sig runt provet, och de överförda röntgenstrålar övervakas av en detektor som också rör sig runt provet. De erhållna röntgen överföringsdata analyseras för att rekonstruera tvärsnittsbilder av preparatet. Denna metod möjliggör observation av interna strukturer utan förstörelse av provet. På grund av dess säkerhet och lätthet, det används ofta i medicinska och tandvård, och CT-system kan hittas på sjukhus och Dental centers över hela världen. Dessutom används industriell röntgen-CT ofta för att observera icke-medicinska prover för inspektion och metrologi på industriområdet. I motsats till medicinska CT, där röntgenkällan och detektorer är rörliga, de två delarna är fasta i industriella CT, med provet roterande under skanning. Industrial CT ger i allmänhet högre upplösning bilder än medicinska CT och kallas microCT (mikrometer-nivå upplösning) eller nanoCT (nanometer-nivå upplösning). Nyligen har forskning med MicroCT snabbt ökat inom olika områden av biologi14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologiska studier med hjälp av CT initialt riktade interna strukturer som huvudsakligen består av hård vävnad, såsom ben. Framsteg inom infärgning tekniker med hjälp av olika kemiska ämnen aktiverat visualisering av mjuk vävnad i olika organismer6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. av dessa reagenser, jod-baserade kontrastmedel är relativt säker, billig, och kan användas för visualisering av mjuk vävnad i olika organismer7,14. När det gäller Marina ryggradslösa djur har MicroCT använts i stor utsträckning på sådana djuren som blötdjur6,25,32,33, maskarna18,19, 20 , 28, och arthoropods21,23,29,31. Det har dock förekommit få rapporter om andra djur phyla, såsom bryozoer6, xenacoelomorphs26, och koraller24,30. I allmänhet, det har varit färre studier med microCT på Marina ryggradslösa djur än de på ryggradsdjur. En viktig orsak till denna begränsade användning av Marina ryggradslösa djur är den stora mångfalden som observerats hos dessa. På grund av sina olika storlekar, morfologier och fysiologier reagerar varje art annorlunda än olika experimentella procedurer. Därför är det avgörande vid provberedning att välja den lämpligaste fixering och Färgnings reagens, och att ställa in förhållanden vid varje steg, justerat för varje art. På samma sätt är det också nödvändigt att ställa in scanning konfigurationer, såsom monteringsmetod, spänning, ström, mekanisk förstoringsgrad, och utrymme upplösning makt, på lämpligt sätt för varje prov. För att övervinna detta problem, en enkel och begriplig manual som täcker alla nödvändiga steg, förklarar hur varje steg kan justeras beroende på preparatet, och visar detaljerade exempel från flera prover är viktigt.
I den nuvarande studien beskriver vi microCT Imaging Protocol steg för steg, från prov fixering till dataanalys, med hjälp av tre Marina ryggradslösa djurarter. Exemplar av havanemon Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) samlades i närheten av Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo. De hade en sfärisk, mjuk kropp som var ca 2 cm i diameter (figur 1A-C). Harmothoe SP. (polychaeta, Annelida) prover samlades också nära Misaki Marine Biological Station. De var smala maskar som var ca 1,5 cm i längd, med tuffa chaetae närvarande längs hela kroppen (figur 1d). En Xenoturbella japonica35 (xenoturbellida, Xenacoelomorpha) prov samlades nära Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba, under den 13: e Jambio Coastal organism gemensamma undersökningen. Det var en mjuk-arbetsföra mask som var ca 0,8 cm i längd (figur 1e). Justeringar som gjorts för de villkor och konfigurationer av varje prov beskrivs i detalj. Vår studie ger flera förslag på hur man utför microCT Imaging på Marina ryggradslösa djur, och vi hoppas att det kommer att inspirera biologer att utnyttja detta protokoll för sin forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixativ med formalin, såsom 10% (v/v) formalin lösning i havsvatten som används i denna studie, är kända för att bevara morfologin av olika Marina ryggradslösa djur och används ofta för MicroCT Imaging18,24,25 ,26,28,30,33. Restriktioner för användningen av denna kemikalie har do…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi skulle vilja tacka Toshihiko Shiroishi för hans hjälp och för att tillhandahålla forskningsmiljön under denna studie. Vi är tacksamma till Kensuke Yanagi och Takato Izumi för råd om A. equina, och Masaatsu Tanaka för råd om Harmothoe SP. specimen. Vi vill tacka Personalen på Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba och Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo för deras hjälp med provsamlingar. Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelsk språk redigering. Detta arbete stöddes av JSPS Grant-in-Aid för unga vetenskapsmän (A) (JP26711022) till HN, och JAMBIO, japanska föreningen för marinbiologi.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
