Actinia equina (cnidaria), harmothoe Sp. (Annelida) ve xenoturbella japonica (xenacoelomorpha) Microfocus X-Ray CT (MicroCT) görüntüleme
Summary
Burada, üç deniz omurgasız hayvanın microfocus X-ışını bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntülenmesi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu çalışmada örnek fiktasyon, boyama, montaj, tarama, görüntü yeniden yapılanma ve veri analizleri gibi adımlar açıklanmaktadır. Protokolün farklı örnekler için nasıl ayarlanacağı konusunda öneriler de sağlanmıştır.
Abstract
Geleneksel olarak, biyologlar opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için kesitleme gibi yıkıcı yöntemlerle güvenmek zorunda kaldılar. Tahribatsız microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (microCT) görüntüleme, Mikroct donanımında örnek boyama yöntemleri ve yenilikleri, bilgisayar işleme ve veri teknolojisinde teknolojik gelişmeler nedeniyle biyoloji alanında güçlü ve gelişmekte olan bir protokol haline gelmiştir. analiz yazılımı. Ancak, bu protokol yaygın olarak kullanılmaz, tıbbi ve endüstriyel alanlarda olduğu gibi. Bu sınırlı kullanım nedenlerinden biri, tüm gerekli adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel eksikliği: örnek toplama, sabitleme, boyama, montaj, tarama, ve veri analizleri. Başka bir nedeni de metazoanların geniş çeşitliliği, özellikle deniz omurgasızlar. Deniz omurgasızlar ‘ farklı boyutlarda, morfolojiler ve fizyolojik nedeniyle, örnek bağlı olarak, her adımda deneysel koşullar ve donanım yapılandırmaları ayarlamak için çok önemlidir. Burada, microCT görüntüleme yöntemleri üç filogenetik olarak çeşitli deniz omurgasızlar kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmıştır: Actinia equina (anthozoa, Cnidaria), harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida), ve xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Çeşitli hayvanlarda microCT görüntülemenin gerçekleştirilmesi konusunda öneriler de sağlanmaktadır.
Introduction
Biyolojik araştırmacılar genellikle ince bölümler yapmak ve opak organizmaların iç yapılarını araştırmak için ışık veya elektron mikroskobu ile gözlem yapmak zorunda kaldılar. Ancak bu yöntemler nadir veya değerli örneklere uygulandığında yıkıcı ve sorunlu olmaktadır. Ayrıca, katıştırma ve bölümleme gibi yöntemdeki birkaç adım zaman alıcı ve protokole bağlı olarak bir örnek gözlemlemek için birkaç gün sürebilir. Dahası, çok sayıda bölümlerin işlenirken, her zaman zarar veya bazı bölümler kaybetme olasılığı vardır. Doku Temizleme teknikleri bazı numuneler için kullanılabilir1,2,3,4,5 ama henüz birçok hayvan türleri için geçerli değildir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için bazı biyologlar microfocus X-Ray bilgisayarlı tomografi (MicroCT) görüntüleme6,7,8,9,10,11, kullanarak başladı 12,13,14,15. X-Ray CT ‘de, numunenin etrafında hareket eden bir X-ışını kaynağından oluşturulan çeşitli açılardan X-ışınları ile radyasyon ışınlanmış ve iletilen X-ışınları da örnek etrafında hareket eden bir dedektör tarafından izlenir. Elde edilen X-ışını iletim verisi, numunenin çapraz kesit görüntülerini yeniden inşa etmek için analiz edilir. Bu yöntem, örnek imha olmadan iç yapıları gözlem sağlar. Onun güvenliği ve kolaylığı nedeniyle, yaygın tıbbi ve diş uygulamalarında kullanılır, ve CT sistemleri hastane ve diş merkezlerinde dünya çapında bulunabilir. Ayrıca endüstriyel X-Ray CT, endüstriyel alanda muayene ve Metroloji için tıbbi olmayan numuneleri gözlemlemek için sıklıkla kullanılır. X-Ray kaynağının ve dedektörlerin mobil olduğu tıbbi CT ‘nin aksine, iki parça endüstriyel CT ‘de sabitlenir, örneğin tarama sırasında döner. Endüstriyel CT genellikle tıbbi CT ‘den daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir ve microCT (mikrometre düzeyinde çözünürlük) veya Naneki (nanometre seviyesi çözünürlüğü) olarak adlandırılır. Son zamanlarda, mikroct kullanarak araştırma hızla biyoloji çeşitli alanlarda arttı14,15,16,17,18,19, 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ‘ dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34.
CT kullanan biyolojik çalışmalar, esas olarak kemik gibi sert dokudan oluşan iç yapıları hedefleyen. Çeşitli kimyasal maddeleri kullanarak boyama tekniklerindeki gelişmeler çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirmeyi sağladı6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 tane , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ‘ dan fazla , 31 , 32 , 33 , 34. bu reaktiflerin, iyot bazlı kontrast maddeleri nispeten güvenli, ucuz ve çeşitli organizmalarda yumuşak dokularda görselleştirme için kullanılabilir7,14. Deniz omurgasızlar ile ilgili olarak, MicroCT yaygın olarak yumuşakçalar gibi hayvanlar üzerinde kullanılmıştır6,25,32,33, annelids18,19, 20 tane , 28ve arthoropods21,23,29,31. Ancak, diğer hayvan phyla hakkında birkaç rapor olmuştur, bryozoalar6gibi, xenacoelomorphs26, ve cnidarians24,30. Genel olarak, Mikroct kullanarak daha az çalışma olmuştur deniz omurgasızlar üzerinde bu omurgalarından daha. Deniz omurgasızlar bu sınırlı kullanım için büyük bir nedeni bu hayvanların gözlenen büyük çeşitlilik olduğunu. Çeşitli boyutları, morfolojileri ve fizyolojik nedeniyle, her tür farklı deneysel prosedürler için değişik tepki verir. Bu nedenle, en uygun sabitleme ve boyama reakajını seçmek için numune hazırlama sırasında ve her tür için ayarlanan her adımda koşulları ayarlamak için çok önemlidir. Benzer şekilde, her örnek için uygun şekilde montaj yöntemi, voltaj, akım, mekanik Büyüteç hızı ve boşluk çözünürlüğü gücü gibi tarama konfigürasyonlarını ayarlamak da gereklidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, gerekli tüm adımları kapsayan basit ve anlaşılabilir bir manuel, her bir adımın örneğe bağlı olarak nasıl ayarlanacağını açıklıyor ve birden fazla örnekten ayrıntılı örnekler esastır.
Bu çalışmada, üç deniz omurgasız türler kullanarak numune sabitleme veri analizinden, Mikroct görüntüleme Protokolü adım adım açıklanmaktadır. Deniz anemon Actinia equina (anthozoa, Cnidaria) örnekleri Tokyo Üniversitesi Misaki deniz biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Bunlar yaklaşık 2 cm çapında (Şekil 1a-C) küresel, yumuşak bir gövdeye sahipti. Harmothoe Sp. (Polychaeta, annelida) örnekleri de Misaki Marine biyolojik İstasyonu yakınında toplandı. Onlar yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda olan ince solucanlar vardı, sert chaetae tüm vücut boyunca mevcut ile (Şekil 1D). A Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) NUMUNESI, 13. Jambıo kıyı organizması ortak araştırması sırasında Tsukuba Üniversitesi Shimoda deniz araştırma merkezi yakınlarında toplandı. Bu yaklaşık 0,8 cm uzunluğunda bir yumuşak gövdeli solucan oldu (Şekil 1E). Her numunenin koşullar ve konfigürasyonları için yapılan ayarlamalar ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bizim çalışma nasıl deniz omurgasızlar üzerinde microCT görüntüleme gerçekleştirmek için çeşitli öneriler sağlar, ve biz onun araştırma için bu protokol kullanmak için biyologlar ilham olacağını umuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada kullanılan deniz suyunda% 10 (v/v) formalin çözeltisi gibi formalin kullanan fixatives, çeşitli deniz omurgasınları morfolojisi korumak için bilinen ve genellikle MicroCT görüntüleme için kullanılan18,24,25 ,26,28,30,33. Ancak, bu kimyasalların kullanımı üze…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Toshihiko Shiroishi ‘ye yardım için ve bu çalışmada araştırma ortamının sağlanması için teşekkür etmek istiyoruz. Biz bir. equinatavsiye Için Kensuke Yanagi ve Takato Izumi için minnettar ve harmothoe Sp. numune üzerinde tavsiye için masaatsu Tanaka. Shimoda Marine Research Center, Tsukuba Üniversitesi ve Misaki Marine biyolojik Istasyonu, Tokyo Üniversitesi ‘nde, örnek koleksiyonlarında yardım almak için personele teşekkür etmek istiyoruz. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, genç bilim adamları için JSPS Grant-ın-Aid (A) (JP26711022) ile HN ve JAMBıO, Japon Deniz Biyolojisi Derneği tarafından destekleniyordu.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
