fcγr पार जोड़ने के जवाब में मैक्रोफेज में ROS उत्पादन के प्रवाह cytometric माप
Summary
इस अध्ययन के प्रवाह cytometry के उपयोग को दर्शाता है प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) fcγr के सक्रियण से उत्पंन उत्पादन का पता लगाने के लिए । यह विधि प्रतिरक्षा परिसरों, opsonized सूक्ष्मजीवों, या प्रत्यक्ष fcγr पार जोड़ने के जवाब में फ़ैगोसाइट के रोगाणुरोधी और रेडॉक्स संकेतन समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
ऑक्सीडेटिव या श्वसन फट को विभिन्न प्रतिरक्षा उत्तेजकों के जवाब में फेगोसाइट्स द्वारा ऑक्सीजन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (ROS) की तेजी से खपत का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रतिरक्षा सक्रियण के दौरान उत्पन्न आरओएस मुख्य रूप से आरओएस की क्षमता को डीएनए और प्रोटीन को नुकसान पहुंचाने, सूक्ष्मजीवों की मौत के कारण प्रबल रोगाणुरोधी गतिविधि डालती है । ROS उत्पादन reproducibly उपाय करने में सक्षम होने के नाते और आसानी से मेजबान रक्षा के इस तंत्र के लिए विभिंन रास्ते और अणुओं के योगदान का आकलन करने के क्रम में आवश्यक है । इस पत्र में, हम फ्लोरोसेंट जांच और प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए ROS उत्पादन का पता लगाने का प्रदर्शन । हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, ros के फ्लोरोसेंट माप बेहद समस्याग्रस्त है, विशेष रूप से विशिष्ट और नहीं mitogenic उत्तेजकों द्वारा प्रेरित ros की माप करने के लिए संबंध है । हम एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत करने के लिए विशिष्ट fcγr उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में उत्पंन ROS का पता लगाने मैक्रोफेज पीढ़ी के साथ शुरू, भड़काना, धुंधला, fcγr पार से जोड़ने, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ समाप्त ।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (ROS) प्रतिक्रियाशील अणुओं या मुक्त कण है कि द्वारा कर रहे हैं-एरोबिक श्वसन के उत्पादों ( 1में की समीक्षा की). इनमें सुपरऑक्साइड एनॉयन, पेरोक्साइड, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, हाइड्रॉक्सिल रेडिकल और हाइड्रॉक्सिल आयन शामिल हैं । सामान्य शारीरिक स्थितियों के तहत, आरओएस मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया और निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लिओटाइड फॉस्फेट (nadph) आक्साइड द्वारा उत्पादित किया जाता है और तेजी से विभिन्न एंजाइमों और प्रोटीन जैसे सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेस और ग्लूटाथिओन के द्वारा detoxified हैं । ros या ros को हटाने की क्षमता में एक दोष के एक अतिरंजित उत्पादन ऑक्सीडेटिव तनाव में परिणाम कर सकते हैं, जिससे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों प्रोटीन, लिपिड की क्षति को बढ़ावा देने, और डीएनए सेलुलर तनाव या मौत और रोगजनक रोग राज्यों के लिए अग्रणी । हालांकि, यह वर्तमान में सराहना की है कि ros भी संकेतन अणुओं के रूप में कार्य कर सकते हैं (redox संकेतन), और विभिन्न अणुओं और मार्ग मध्यवर्ती के ros-मध्यस्थता संशोधन सेलुलर चयापचय को प्रभावित कर सकते हैं, प्रसार, अस्तित्व, भड़काऊ सिग्नलिंग, और एजिंग2. फैगोसाइटिक कोशिकाओं में, ROS तथाकथित “श्वसन फट”1,3,4,5,6के दौरान रोगाणुरोधी गतिविधि प्रदान करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । बाहरी उत्तेजनों के लिए फ़ैगोसाइट की प्रतिक्रिया के दौरान, nadph ऑक्सीडेस परिसर (p40 phox, p47phox, p67phox) के घटकों को cytosol से फेगोसोमल झिल्ली को translocate gp91phox और p22phox युक्त उपइकाइयों, और एक साथ Rac1/2 के कार्यों के साथ, एक पूरी तरह कार्यात्मक nadph ऑक्सीडेस एंजाइम परिसर के रूप में । इकट्ठे nadph ऑक्सीडेस तो इस्तेमाल करता है nadph फैगोसोमल vacuole के भीतर सुपरऑक्साइड को ऑक्सीजन को कम करने के लिए । सुपरऑक्साइड anions सीधे नुकसान का कारण या हाइड्रोजन पेरोक्साइड में dismutated जा सकता है । दोनों सुपरऑक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड अंय अणुओं के साथ प्रतिक्रिया के लिए अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल कण उत्पंन कर सकते हैं । नुकसान प्रोटीन पर लौह सल्फर समूहों के साथ या डीएनए के आधार ऑक्सीकरण के कारण, अंततः प्रतिबंधित माइक्रोबियल चयापचय या सूक्ष्म जीव5की मौत के लिए अग्रणी के साथ इन ROS की प्रतिक्रिया से मध्यस्थता है । nadph ऑक्सीडेस एंजाइम परिसर और सांस फट के दौरान उत्पादित ROS के महत्व क्रोनिक granulomatous रोग (cgd) के साथ रोगियों में चिकित्सकीय सचित्र है7,8,9, 10. cgd के साथ व्यक्तियों gp91phox में परिवर्तन के पास, ROS उत्पादन और बैक्टीरिया और कवक जो आमतौर पर असुरक्षित व्यक्तियों के साथ एक चिंता नहीं कर रहे है के साथ आवर्तक संक्रमण के लिए संवेदनशीलता की कमी में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, चाहे अध्ययन ऑक्सीडेटिव तनाव, रेडॉक्स संकेतन, या मेजबान रक्षा, वास्तविक समय में ROS उत्पादन को मापने के लिए सक्षम किया जा रहा एक उपयोगी प्रयास है ।
एकाधिक assays ROS उत्पादन या ऑक्सीडेटिव तनाव11,12,13के परिणाम को मापने के लिए उपयोग किया गया है । इनमें से एक, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच 2 ‘, 7 ‘ dichlorodihydrofluorescein डाइएसीटेट (dcfh2-डीए)14है । यह अणु रंगहीन और लिपोफिलिक है । dcfh2के प्रसार-सेल झिल्ली भर में डीए यह इंट्रासेलर esterases द्वारा पर काम किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जो यह dcfh 2 में deacetylates, यह सेल impermeable प्रतिपादन । आरओएस के कई प्रकार (हाइड्रोजन पेरोक्साइड, पेराऑक्सीनाइट्राइट, हाइड्रॉक्सिल कण, नाइट्रिक ऑक्साइड, और पेरॉक्सी कण) के कार्य dcfh2 पर यह dcf में oxidize जो फ्लोरोसेंट है (रिपोर्ट पूर्व Em: 485-500 एनएम/515-530 एनएम) और एक प्रवाह का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है cytometer एक मानक फिल्टर fluorescein (FL1 चैनल) के लिए सेट के साथ सुसज्जित । superoxide दृढ़ता से dcfh2 के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है, लेकिन एक और जांच dihydroethidium (DHE) के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए फ्लोरोसेंट उत्पाद 2-हाइड्रोक्सीथिडियम (साथ ही अन्य फ्लोरोसेंट superoxide-स्वतंत्र ऑक्सीकरण उत्पादों)15उपज कर सकते हैं । DHE ऑक्सीकरण के फ्लोरोसेंट उत्पादों ५१८ एनएम की एक उत्तेजना तरंग दैर्घ्य और ६०५ एनएम (FL2 चैनल) के उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है । हालांकि अपेक्षाकृत उपयोग करने के लिए सरल, ROS का पता लगाने के लिए इन जांच का उपयोग अपनी सीमाओं के ज्ञान और विशिष्ट परख में धुंधला प्रक्रियाओं और नियंत्रण की सावधानी से निगमन की आवश्यकता है क्रम में किया जा रहा है वैध प्रयोगात्मक परिणाम और निष्कर्ष । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग को प्रदर्शित इन 2 जांच प्रवाह cytometry द्वारा ROS उपाय करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । हम इन जांच और fcγr पार जोड़ने के माध्यम से आरओएस उत्पादन प्रेरित के साथ अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज दाग । हम इस प्रोटोकॉल और तनाव उचित सावधानियों कि सफल प्रयोग के लिए शुरू किया जाना चाहिए का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
dcfh2-डीए और DHE-ROS का पता लगाने आधारित एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है14,15। उपयोग की आसानी और गतिज माइक्रोप्लेट स्वरूपों के लिए इन ROS जांच के अनुकूलनशीलता, प्रतिदीप्ति माइक्र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को प्रयोगशाला रखरखाव और माउस कॉलोनी अनुरक्षण में उनकी मदद के लिए madelyn एच मिलर, उमर carडोना, andjie जीयूडी, और roopin सिंह सहित टिग्नो-आर्जुएज़ लैब के अंय सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस शोध के लिए सहायता अनुदान R00 HL122365 और स्टार्ट-अप फंडों द्वारा जे. टी. टी-ए को प्रदान की गई.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
