Misurazione del flusso Cytometric di produzione di ROS nei macrofagi In risposta a FcγR cross-linking
Summary
Questo studio dimostra l’uso di citometria a flusso per rilevare produzione reattiva dell’ossigeno specie (ROS) derivanti dall’attivazione della FcγR. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella funzione dei fagociti in risposta a complessi immuni, opsonized microrganismi o diretto FcγR cross-linking di segnalazione redox e antimicrobico.
Abstract
Il burst ossidativo o respiratorio è usato per descrivere il rapido consumo di ossigeno e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) da parte dei fagociti in risposta a vari stimoli immuni. ROS generati durante l’attivazione del sistema immunitario esercita la potente attività antimicrobica principalmente attraverso la capacità di ROS di danneggiare il DNA e proteine, causando la morte dei microrganismi. Essere in grado di misurare la produzione di ROS riproducibile e con facilità è necessario al fine di valutare il contributo dei vari meccanismi e nuove molecole per questo meccanismo di difesa ospite. In questa carta, dimostriamo l’utilizzo di sonde fluorescenti e flusso cytometry per rilevare la produzione di ROS. Anche se ampiamente utilizzato, misure in fluorescenza di ROS sono notoriamente problematica, soprattutto per quanto riguarda la misura del ROS indotta da stimoli specifici e non mitogenici. Vi presentiamo una dettagliata metodologia per rilevare ROS generati a seguito di stimolazione specifica di FcγR cominciando con generazione del macrofago, adescamento, colorazione, FcγR cross-linking e termina con l’analisi cytometric di flusso.
Introduction
Specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono molecole reattive o i radicali liberi che sono sottoprodotti della respirazione aerobica (rivisto in 1). Questi includono l’anione superossido, il perossido, perossido di idrogeno, radicale ossidrile e ioni dell’idrossile, tra gli altri. In condizioni fisiologiche normali, ROS sono prodotte principalmente dalla mitocondri e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi e sono rapidamente disintossicati da vari enzimi e proteine quali superossido dismutasi e glutatione. Una produzione esagerata di ROS o un difetto nella capacità di rimuovere ROS può causare stress ossidativo, per cui le specie reattive dell’ossigeno promuovono il danno di proteine, lipidi e DNA che portano a stress cellulare o morte e Stati di malattia patologica. Tuttavia, attualmente è apprezzato che ROS può anche fungere da molecole di segnalazione (segnalazione redox), e modifica ROS-mediato di varie molecole e via intermedi può influire sul metabolismo cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza, infiammatoria segnalazione e invecchiamento2. In cellule fagocitiche, ROS svolge un ruolo essenziale nel fornire attività antimicrobica durante il cosiddetto “scoppio respiratorio”1,3,4,5,6. Durante la risposta dei fagociti agli stimoli esterni, componenti della NADPH ossidasi complessa (p40phox, p47phox, p67phox) traslocano dal citosol alla membrana phagosomal contenente la gp91phox e p22phox subunità, e insieme alle azioni di Rac1/2, formano un enzima di NADPH ossidasi completamente funzionale e complesso. L’ossidasi di NADPH assemblato allora utilizza NADPH per ridurre l’ossigeno a superossido all’interno del vacuolo phagosomal. Gli anioni superossido possono direttamente causare danni o essere dismutated in perossido di idrogeno. Perossido di idrogeno e del superossido può reagire con altre molecole per generare i radicali ossidrile altamente reattivo. Danno è mediato dalla reazione di questi ROS con cluster ferro-zolfo sulle proteine o provocando ossidazione del DNA, infine conducendo alla limitato metabolismo microbico o morte del microbo5. L’importanza dell’enzima NADPH ossidasi complessa e ROS, prodotte durante lo scoppio respiratorio è illustrata clinicamente in pazienti con malattia granulomatosa cronica (CGD)7,8,9, 10. gli individui con CGD possiedono mutazioni in gp91phox, risultante in una mancanza di produzione di ROS e suscettibilità alle infezioni ricorrenti con batteri e funghi che di solito non sono una preoccupazione con individui immunocompetent. Pertanto, se studiare ossidativo stress, segnalazione redox o difesa ospite, essere in grado di misurare la produzione di ROS in tempo reale è uno sforzo utile.
Analisi multiple sono state utilizzate per la produzione di ROS di misura o i risultati di stress ossidativo11,12,13. Tra questi, uno dei più utilizzati è la sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (2DCFH -DA)14. Questa molecola è incolore e lipofilico. Diffusione di DCFH2-DA attraverso la membrana cellulare permette di essere agito da esterasi intracellulari, che si deacetylates in DCFH2, rendendolo cellulare impermeabile. Le azioni di più tipi di ROS (perossido di idrogeno, peroxynitrite, i radicali ossidrili, ossido nitrico e perossi radicali) su DCFH2 si ossidano in DCF che è fluorescente (segnalati Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e può essere rilevato tramite un flusso citometro dotato di un filtro standard impostato per fluoresceina (canale FL1). Superossido non reagisce fortemente con DCFH2 ma può reagire con un’altra sonda diidroetidio (DHE) per produrre il prodotto fluorescente 2-hydroxyethidium (così come altri prodotti di ossidazione di superossido-indipendente fluorescente)15. I prodotti fluorescenti di ossidazione DHE possono essere rilevati utilizzando una lunghezza d’onda di eccitazione di 518 nm e una lunghezza d’onda di emissione di 605 nm (canale FL2). Anche se relativamente semplice da usare, l’utilizzo di queste sonde per il rilevamento di ROS richiede la conoscenza dei loro limiti e attenta incorporazione di macchiatura procedure e controlli nel dosaggio specifico viene eseguito al fine di avere validi sperimentale risultati e conclusioni. Il protocollo riportato di seguito viene illustrato l’utilizzo di un kit disponibile in commercio che impiegano questi 2 sonde progettate per misurare il ROS tramite flusso cytometry. Abbiamo macchia innescati derivate da midollo osseo macrofagi con queste sonde e indurre la produzione di ROS attraverso FcγR cross-linking. Presentiamo dati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo e sottolineare le opportune precauzioni che devono essere intraprese per la sperimentazione di successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DCFH -DA e rilevazione basata su DHE di ROS è una tecnica ampiamente usato14,15. Facilità d’uso e l’adattabilità di queste sonde ROS per micropiastra cinetica formati, analisi di cytometric di flusso o microscopia di fluorescenza ha contribuito alla loro popolarità. Tuttavia, nei nostri studi di funzioni FcγR-mediata del macrofago, ci non sembrano essere un protocollo standard per l’esecuzione di questo test per analisi citofluorimetrica delle ce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare altri membri del laboratorio Tigno-Aranjuez inclusi Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh per il loro aiuto nella manutenzione di Colonia di manutenzione e topo di laboratorio. Il supporto per questa ricerca è stato fornito da grant R00 HL122365 e fondi di Start-up a J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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