Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking
Summary
Denne studien demonstrerer bruken av flowcytometri å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) produksjon skyldes aktivering av FcγR. Denne metoden kan brukes til å vurdere endringer i antimikrobielle og redoks signalnettverk funksjon av phagocytes immun komplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.
Abstract
Oksidativt eller respirasjonssykdommer utbrudd brukes til å beskrive raske forbruket av oksygen og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS) av phagocytes svar på ulike immun stimuli. ROS genereres under immun aktivisering utøver potente antimikrobielle aktivitet primært gjennom evne til ROS å skade DNA og proteiner, forårsaker død av mikroorganismer. Å kunne måle ROS produksjon reproduserbar og Peterkirken er nødvendig for å vurdere bidrag av ulike veier og molekyler til denne mekanismen av vert forsvar. I dette papiret, vi demonstrerer bruken av fluorescerende sonder og flow cytometri for å oppdage ROS produksjon. Selv om mye brukt, er fluorescerende måling av ROS svært problematisk, særlig med hensyn til måling av ROS av bestemt og ikke mitogenic stimuli. Vi presenterer en detaljert metodikk for å oppdage ROS generert spesiell FcγR stimulering med macrophage generasjon grunning, flekker, FcγR cross-linking og slutter med flyt cytometric analyse.
Introduction
Reaktive oksygen arter (ROS) er reaktive molekyler eller frie radikaler som er biprodukter i aerobic åndedrett (omtalt i 1). Disse inkluderer den superoxide anion peroxide, hydrogen peroxide, hydroksyl radikale og hydroksyl ioner, blant andre. Under normale fysiologiske, ROS produseres hovedsakelig av mitokondrier og nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH) oxidases og er raskt detoxified av ulike enzymer og proteiner som superoxide dismutase og glutation. En overdreven produksjon av ROS eller feil kan fjerne ROS kan føre oksidativt stress, der frie radikaler fremme skade av proteiner og lipider DNA som fører til mobilnettet stress eller død og patologisk sykdomstilstander. Men er det for tiden verdsatt at ROS kan også fungere som signalnettverk molekyler (redoks signalisering), og ROS-mediert endring av ulike molekyler og veien mellomprodukter kan påvirke cellenes stoffskifte, spredning, overlevelse, inflammatorisk signalisering og aldring2. Phagocytic cellene: ROS spiller en viktig rolle i å gi antimikrobielle aktivitet under såkalte “åndedretts brast”1,3,4,5,6. Under responsen av phagocytes på eksterne stimuli translocate komponenter i den NADPH oksidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra stoffer til phagosomal membranen som inneholder gp91phox og p22phox tenkes, og sammen med handlinger Rac1/2, en fullt funksjonell NADPH oksidase enzym komplekse. Den sammensatte NADPH oksidase benytter deretter NADPH for å redusere oksygen til superoxide innen den phagosomal vacuole. Superoxide anioner kan direkte forårsake skade eller bli dismutated i hydrogenperoksid. Både superoxide og hydrogen peroxide kan reagere med andre molekyler å generere svært reaktive hydroksylradikaler. Skade er formidlet av reaksjonen av disse ROS med jern-svovel klynger på proteiner eller forårsaker base oksidasjon av DNA, slutt fører til begrenset mikrobiell metabolisme eller død av mikrobe5. Betydningen av NADPH oksidase enzym komplekse og ROS produsert under respiratory utbrudd illustreres klinisk hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD har mutasjoner i gp91phox, noe som resulterer i mangel på ROS produksjon og mottakelighet for tilbakevendende infeksjoner med bakterier og sopp som ikke vanligvis er et problem med immunkompetente personer. Derfor om studere oksidativt stress, redox signalering eller vert forsvar, å kunne måle er ROS produksjon i sanntid en nyttig oppgave.
Flere analyser har vært benyttet til mål ROS produksjon eller resultatet av oksidativt stress11,12,13. Blant disse er en av de mest brukte lysstoffrør sonde 2, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Dette molekylet er fargeløs og lipofile. Spredningen av DCFH2-DA over cellemembranen kan det følges av intracellulær esterases, som deacetylates det i DCFH2, gjengi det celle ugjennomtrengelig. Handlingene til flere typer ROS (hydrogenperoksid, peroxynitrite, hydroksylradikaler, nitrogenoksid og peroxy radikaler) på DCFH2 oksidere det i DCF som er fluorescerende (rapporterte Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan oppdages ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med en standard filtersettet for fluorescein (FL1-kanal). Superoxide reagerer ikke sterkt med DCFH2 , men kan reagere med en annen sonde dihydroethidium (DHE) å gi fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxide uavhengig oksidasjonsprodukter)15. Fluorescerende produkter av DHE oksidasjon kan oppdages ved hjelp av en eksitasjon bølgelengden til 518 nm og et utslipp bølgelengden til 605 nm (FL2 kanal). Selv om det er relativt enkel å bruke, krever utnyttelse av disse sonder deteksjon av ROS kunnskap om sine begrensninger og forsiktig innlemmelse av flekker prosedyrer og kontroller i bestemte analysen utføres for å ha gyldig eksperimentell resultater og konklusjoner. Følgende protokollen demonstrerer bruken av en kommersielt tilgjengelig kit ansette disse 2 sonder laget for å måle ROS av flowcytometri. Vi flekken primet Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med disse sonder og indusere ROS produksjon gjennom FcγR cross-linking. Vi presenterer representant data innhentet bruker denne protokollen og stress forsiktighetsregler som må foretas for vellykket eksperimentering.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA og DHE-basert oppdagelsen av ROS er en brukte teknikken14,15. Brukervennlighet og tilpasningsevne disse ROS sonder for kinetisk microplate formater, fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidratt til deres popularitet. Men i våre studier av FcγR-mediert macrophage funksjoner synes det ikke å være en standardprotokoll for å utføre denne analysen for flyt cytometric analyse av FcγR krysskoblet celler. Gitt den reaktive n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke andre medlemmer av det Tigno-Aranjuez inkludert Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjelp i laboratoriet vedlikehold og mus kolonien vedlikehold. Støtte for denne forskningen ble levert av grant R00 HL122365 og oppstart midler til J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
