Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking
Summary
Denna studie visar användningen av flödescytometri att upptäcka reaktivt syre arter (ROS) produktion följd aktivering av FcγR. Denna metod kan användas för att bedöma förändringar i antimikrobiella och redox signalering funktion av fagocyter i svar till immunkomplex, opsonized mikroorganismer eller direkt FcγR cross-linking.
Abstract
Oxidativa eller respiratorisk burst används att beskriva snabb konsumtion av syre och generering av reaktiva syreradikaler (ROS) av fagocyter som svar på olika immun stimuli. ROS som genereras under immunsystemets aktivering utövar potent Antimikrobiell aktivitet främst genom ROS förmåga att skada DNA och proteiner, orsakar döden av mikroorganismer. Att kunna mäta ROS produktion reproducibly och med lätthet är nödvändigt för att bedöma olika vägar och molekyler till denna mekanism av värd försvar bidrag. I detta papper, vi demonstrera användningen av fluorescerande sonder och flödescytometri för att upptäcka ROS produktion. Även om utbrett, är fluorescerande mätning av ROS notoriskt problematiska, särskilt när det gäller mätning av ROS som induceras av specifika och inte mitogena stimuli. Vi presenterar en detaljerad metod för att upptäcka ROS som genereras till följd av specifika FcγR stimulering börjar med makrofag generation, grundning, färgning, FcγR cross-linking och slutar med flöde flödescytometrisk analys.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) är reaktiva molekyler eller fria radikaler som är biprodukter av aerob respiration (ses i 1). Dessa inkluderar den superoxid anjon, peroxid, väteperoxid, hydroxyl radikala och hydroxyljoner, bland andra. Under normala fysiologiska förhållanden, ROS produceras främst av mitokondrier och nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADPH) oxidases och är snabbt Dekon-olika enzymer och proteiner som superoxiddismutas och glutation. En överdriven produktion av ROS eller en defekt i förmågan att ta bort ROS kan leda till oxidativ stress, whereby reaktiva syreradikaler främja skadan av proteiner, lipider och DNA vilket leder till cellulär stress eller död och patologiska sjukdomstillstånd. Men uppskattas det för närvarande att ROS kan också fungera som signalmolekyler (redox signalering) och ROS-medierad modifiering av olika molekyler och pathway intermediärer kan påverka cellulär metabolism, spridning, överlevnad, inflammatoriska signalering och åldrande2. I Fagocytos celler spelar ROS en viktig roll i att tillhandahålla Antimikrobiell aktivitet under den så kallade ”respiratory burst”1,3,4,5,6. Under fagocyter svar på yttre stimuli translocate komponenter av NADPH-oxidas komplexa (p40phox, p47phox, p67phox) från cytosolen till phagosomal membranet som innehåller gp91phox och p22phox subenheter, och tillsammans med åtgärderna för Rac1/2, bildar en fullt fungerande NADPH-oxidas enzymkomplex. Den monterade NADPH-oxidasen använder sedan tredjeparts NADPH för att reducera syre till superoxid inom den phagosomal vakuol. Superoxid anjoner kan direkt skada eller vara dismutated i väteperoxid. Både superoxid och väteperoxid kan reagera med andra molekyler för att generera mycket reaktiva hydroxylradikaler. Skador medieras genom reaktion av dessa ROS med järn-svavel kluster på proteiner eller orsakar bas oxidering av DNA, vilket slutligen leder till begränsad mikrobiell metabolism eller döden av mikrob5. Betydelsen av NADPH-oxidas enzymet komplexa och ROS som producerats under respiratory burst illustreras kliniskt på patienter med kronisk granulomatös sjukdom (CGD)7,8,9, 10. individer med CGD besitter mutationer i gp91phox, vilket resulterar i en brist på ROS produktion och känslighet för återkommande infektioner med bakterier och svampar som inte vanligtvis är ett bekymmer med immunkompetenta individer. Därför, om studera oxidativ stress, redox signalering eller värd försvar, att kunna mäta ROS produktionen i realtid är en användbar strävan.
Flera analyser har utnyttjats till åtgärd ROS produktion eller resultaten av oxidativ stress11,12,13. Bland dessa är en av de mest använda fluorescerande sond 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Denna molekyl är färglös och lipofila. Diffusionen av DCFH2-DA över cellmembranet gör att den kan vara handlat av intracellulära esteraser, som deacetylates det i DCFH2, gör den cell ogenomtränglig. Åtgärder av flera typer av ROS (väteperoxid, peroxynitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid och peroxy radikaler) på DCFH2 oxidera det till DCF som är fluorescerande (rapporterade Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) och kan upptäckas med hjälp av ett flöde cytometer utrustad med ett standardfilter för fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerar inte starkt med DCFH2 men kan reagera med en annan sond dihydroethidium (DHE) ge de fluorescerande produkt 2-hydroxyethidium (liksom andra fluorescerande superoxid-oberoende oxidationsprodukter)15. De fluorescerande produkterna DHE oxidation kan upptäckas med hjälp av en magnetisering våglängd 518 nm och emissionsvåglängden 605 nm (FL2 kanal). Även om det är relativt enkelt att använda, kräver utnyttjande av dessa sonder för detektion av ROS kunskap om sina begränsningar och försiktig införlivandet av färgning förfaranden och kontroller till specifika analysen utförs för att ha giltiga experimentella resultat och slutsatser. Följande protokoll visar användningen av ett kommersiellt tillgängliga kit anställa dessa 2 givare för att mäta ROS av flödescytometri. Vi fläcken primade benmärg-derived makrofager med dessa sonder och framkalla ROS produktion genom FcγR cross-linking. Vi presenterar representativa uppgifter som erhållits med hjälp av detta protokoll och betona lämpliga försiktighetsåtgärder som måste vidtas för framgångsrika experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA och DHE-baserad detektion av ROS är en allmänt använd teknik14,15. Användarvänlighet och anpassningsförmåga av dessa ROS sonder för kinetiska mikroplattan format, fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometrisk analys har bidragit till deras popularitet. Dock i våra studier av FcγR-medierad makrofag funktioner verkade det inte vara ett standardprotokoll för att utföra denna analys för flöde flödescytometrisk analys av Fc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka övriga ledamöter i Tigno-Aranjuez labbet inklusive Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy och Roopin Singh för deras hjälp i laboratoriet underhåll och mus kolonin underhåll. Stöd för denna forskning tillhandahölls av grant R00 HL122365 och nystartade fonder till J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
