Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking
Summary
Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.
Abstract
O burst oxidativo ou respiratório é usado para descrever o rápido consumo de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos fagócitos em resposta a vários estímulos imunes. ROS, gerados durante a ativação imune exerce potente atividade antimicrobiana, principalmente através da capacidade de ROS de danificar o DNA e proteínas, causando a morte de microorganismos. Ser capaz de medir a produção de ROS reproducibly e com facilidade é necessário a fim de avaliar a contribuição de vários caminhos e moléculas deste mecanismo de defesa do hospedeiro. Neste artigo, demonstramos a utilização de sondas fluorescentes e fluxo cytometry para detectar a produção de ROS. Apesar de amplamente utilizado, medição fluorescente de ROS é notoriamente problemática, especialmente com relação à medição de ROS induzida por estímulos específicos e não mitogênico. Apresentamos uma metodologia detalhada para detectar ROS gerada como resultado específico FcγR estimulação, começando com a geração de macrófagos, escorva, coloração, FcγR cross-linking e terminando com a análise de fluxo cytometric.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em 1). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactivas de oxigénio promovem os danos de proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou morte e Estados de doença patológica. No entanto, atualmente é apreciado que ROS também pode atuar como moléculas sinalizadoras (sinalização redox), e mediada por ROS modificação de várias moléculas e via intermediários pode influenciar o metabolismo celular, proliferação, sobrevivência, inflamatória sinalização e envelhecimento2. Em células fagocíticas, ROS desempenha um papel essencial no fornecimento de atividade antimicrobiana durante a chamada “explosão respiratória”1,3,4,5,6. Durante a resposta dos fagócitos a estímulos externos, componentes da oxidase NADPH complexo (p40phox, p47phox, p67phox) translocar do citosol para a membrana phagosomal, que contém a gp91phox e p22phox subunidades, e juntamente com as ações do Rac1/2, formam um totalmente funcional NADPH oxidase complexo enzimático. A oxidase de NADPH montado então utiliza NADPH para reduzir o oxigênio ao superóxido dentro do vacúolo phagosomal. Ânions superóxido diretamente podem causar danos ou ser dismutated em peróxido de hidrogênio. Tanto o superóxido e o peróxido de hidrogênio podem reagir com outras moléculas para gerar radicais hidroxila altamente reativos. Dano é mediado por reação destas ROS com proteínas ferro-enxofre ou causando oxidação base de DNA, conduzindo finalmente ao metabolismo microbiano restrito ou morte do micróbio5. A importância da enzima oxidase NADPH complexa e ROS produzidos durante a explosão respiratória é ilustrado clinicamente em pacientes com doença granulomatosa crônica (CGD)7,8,9, 10. indivíduos com CGD possuem mutações em gp91phox, resultando em uma falta de produção de ROS e susceptibilidade a infecções com bactérias e fungos que normalmente não são uma preocupação com os indivíduos imunocompetentes. Portanto, se estudar oxidativo estresse, sinalização redox ou defesa do hospedeiro, sendo capaz de medir a produção de ROS em tempo real é um esforço útil.
Vários ensaios têm sido utilizados para a produção de ROS de medida ou os resultados do stress oxidativo11,12,13. Entre estes, um do mais amplamente utilizado é a sonda fluorescente 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo2-DA)14. Esta molécula é lipofílico e incolor. Difusão de Diniz Melo2-DA através da membrana celular permite a ser postas em prática por esterases intracelulares, que deacetylates-lo em Diniz Melo2, tornando-se células impermeáveis. As ações de vários tipos de ROS (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico e radicais de peróxido) na Diniz Melo2 -oxidam em DCF, que é fluorescente (relatado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e pode ser detectada usando um fluxo citômetro equipado com um filtro padrão definido para fluoresceína (FL1 canal). Superóxido pode reagir com outra sonda dihydroethidium (DHE) para produzir o produto fluorescente 2-hydroxyethidium (bem como outros produtos de oxidação de superóxido independente fluorescente)15, mas não reage fortemente com Diniz Melo2 . Produtos de oxidação DHE fluorescentes podem ser detectados usando um comprimento de onda de excitação de 518 nm e um comprimento de onda de emissão de 605 nm (canal FL2). Embora relativamente simples de usar, a utilização de tais sondas para a deteção de ROS requer conhecimento de suas limitações e cuidadosa incorporação de coloração procedimentos e controles para o ensaio específico, sendo realizado a fim de ter válido experimental resultados e conclusões. O protocolo a seguir demonstra o uso de um kit disponível comercialmente, empregando estes 2 sondas projetadas para medir ROS por citometria de fluxo. Podemos manchar aprontados macrófagos derivados da medula óssea com estas sondas e induzir a produção de ROS através do cross-linking FcγR. Apresentamos dados representativos obtidos usando este protocolo e sublinhar as devidas precauções que devem ser empreendidas para experimentação bem sucedida.
Protocol
Representative Results
Discussion
2-[NULL] de Diniz Melo e detecção baseada em DHE de ROS é uma técnica amplamente utilizada14,15. Facilidade de uso e a adaptabilidade destas sondas ROS para formatos de microplacas cinética, análise de fluorescência microscopia ou fluxo cytometric contribuiu para sua popularidade. No entanto, em nossos estudos de funções de macrófagos mediada por FcγR, lá não parecem ser um protocolo padrão para a realização deste ensaio para análise d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a outros membros do laboratório Tigno-Aranjuez incluindo Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh por sua ajuda na manutenção de colônia de manutenção e rato de laboratório. Suporte para esta pesquisa foi fornecido por grant R00 HL122365 e fundos de start-up para J.T.T-A.
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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