Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel
Summary
Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.
Abstract
Behandelingsopties voor aangeboren of secundaire lange segment tracheale gebreken historisch beperkt gebleven als gevolg van een onvermogen om functionele weefsel vervangen. Weefselengineering houdt grote belofte als een mogelijke oplossing met haar vermogen om te integreren van cellen en signalering moleculen in een 3-dimensionale steiger. Recent werk met weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) heeft gezien enig succes, maar hun vertaling heeft is beperkt door de stenose van de graft, graft ineenstorting en epithelialization vertraagd. Om te onderzoeken de mechanismen die deze kwesties rijden, hebben we een muismodel voor weefsel ontworpen tracheale graft implantatie. TETGs werden gebouwd met behulp van electrospun polymeren polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) in een mengsel van PET en PU (20:80 percentage gewicht). Steigers werden vervolgens bezaaid met behulp van beenmerg mononucleaire cellen geïsoleerd van 6-8 week-oude C57BL/6 muizen door kleurovergang centrifugeren. Tien miljoen cellen per graft waren uitgezaaid op het lumen van de steiger en toegestaan om te broeden ‘s nachts vóór implantatie tussen de derde en zevende de tracheale ringen. Deze transplantaties in staat waren om de bevindingen van stenose recapituleren en vertraagd epithelialization zoals blijkt uit de histologische analyse en gebrek aan keratine 5 en keratine 14 basale epitheliale cellen op immunofluorescentie. Dit model zal dienen als een instrument voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn in het remodelleren van de ontvangst.
Introduction
Lange-segment tracheale gebreken kunnen presenteren als zeldzame aangeboren aandoeningen zoals volledige tracheale ringen tracheale agenesie, evenals trauma, maligniteit en infectie. Wanneer meer dan 6 cm in volwassenen of 30% van de trachea lengte bij kinderen, worden deze gebreken niet behandeld door chirurgische reconstructie. Pogingen om de luchtweg vervangen door autoloog weefsel, dode foetussen transplantaties en kunstmatige constructies hebben geteisterd door chronische infectie, granulatie, mechanische storing en stenose.
Weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) kunnen potentieel deze problemen aangepakt terwijl het vermijden van de noodzaak van levenslang bij immuunsuppressie. In het laatste decennium, zijn TETGs getest in diermodellen en klinisch gebruikt in zeldzame gevallen voor gebruik in schrijnende gevallen1,2,3. In zowel de klinische als de grote dierproeven, post-operatieve herstel van weefsel ontworpen airway vervanging vereist vele interventies voor de bestrijding stenose (gedefinieerd als > 50% luminal vernauwing) en onderhouden van de luchtwegen bij. Extra TETG werk heeft getracht om deze stenose door evaluatie van de rol van cel seeding keuze, vascularisatie en steiger ontwerp. Cel seeding keuzes en steiger ontwerp voor het herstel van de inheemse luchtpijp structuur/functie hebben hoofdzakelijk gericht geweest op de luchtwegen epitheliale cellen en chondrocyten ontpit op verschillende resorbeerbare, niet-resorbeerbare en decellularized steigers. Zoals vascularisatie waarschijnlijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van stenose speelt, hebben andere groepen gericht op het optimaliseren van in vitro of heterotopic modellen voor het versnellen van revascularisatie of neoangiogenesis4. Succesvolle vascularisatie ook behoud van een mechanisch bevoegde en functionele TETG bereiken blijft echter een uitdaging. Ondanks de recente vooruitgang blijft minimaliseren van stenose een belangrijke belemmering klinische vertaling.
Om te onderzoeken dit histopathologisch antwoord op TETG implantatie in vivo, ontwikkelden we een schapen model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. De prothese was samengesteld uit een gemengde polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) electrospun steiger bezaaid met beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MDL). In dit kleine cohort bewezen we dat geplaatste autologe BM-MDL opnieuw epithelialization versnelde en vertraagd stenose5. Hoewel zaaien met autologe BM-MDL verbeterd overleven, blijft de cellulaire mechanisme waarmee BM-MDL de vorming van functionele neotissue moduleren onduidelijk.
Onderzoek op het cellulaire niveau vereist ontwikkeling van een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. Gelijkaardig aan de schapen studie, wij gebruikt een PET:PU electrospun steiger bezaaid met BM-MDL. Consistent met de schapen model, TETG stenose ontwikkelde in de loop van de eerste twee weken na implantatie1,2,3 ,5. Dit stelde dat de lymfkliertest model gerecapituleerd de pathologie waargenomen eerder, zodat we kunnen verder ondervragen de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de luchtweg stenose.
In dit verslag detailleren wij ons protocol voor weefsel ontworpen tracheale vervanging in het muismodel met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie (Figuur 1, Figuur 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ontwikkeling van een muismodel voor weefsel ontworpen tracheas is essentieel in het begrip van de factoren die hebben beperkte klinische vertaling van de TETGs; namelijk graft ineenstorting, stenose en vertraagde epithelialization4. Een paar factoren die aan deze beperkingen bijdragen omvatten selectie van graft materiaal, het productieproces, de steiger ontwerp en de cel protocollen zaaien. Dit model zorgt voor snellere evaluatie van deze factoren om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen erkennen van Robert Strouse en de Research Information Solutions & innovaties divisie in landelijk Children’s Hospital voor hun steun in grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
