Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים
Summary
היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.
Abstract
אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.
Introduction
פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס”מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.
שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,–2,–3. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis4. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.
כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות5. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.
חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה1,2,3 ,5. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.
בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology – Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology – Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
