एक माउस मॉडल में एक जैव सिंथेटिक ऊतक इंजीनियर Tracheal भ्रष्टाचार के बोने और आरोपण
Summary
Graft एक प्रकार का रोग ऊतक में एक महत्वपूर्ण बाधा बन गया है एयरवे रिप्लेसमेंट इंजीनियर । एक प्रकार का रोग अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए, हम बोये अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-MNC) के साथ ऊतक इंजीनियर ट्रेकल रिप्लेसमेंट के एक म्यूरिन मॉडल का उपयोग । यहां, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण सहित हमारे प्रोटोकॉल, ।
Abstract
जन्मजात या माध्यमिक लंबे खंड वातक दोषों के लिए उपचार के विकल्प ऐतिहासिक रूप से कार्यात्मक ऊतक की जगह असमर्थता के कारण सीमित किया गया है । ऊतक इंजीनियरिंग एक 3 आयामी पाड़ में कोशिकाओं और संकेत अणुओं को एकीकृत करने की क्षमता के साथ एक संभावित समाधान के रूप में महान वादा रखती है । ऊतक के साथ हाल ही में काम कर रहे है वातक grafts इंजीनियर (tetgs) कुछ सफलता देखा है, लेकिन उनके अनुवाद grafts stenosis, भ्रष्टाचार पतन, और देरी उपकला द्वारा सीमित किया गया है । आदेश में इन मुद्दों ड्राइविंग तंत्र की जांच करने के लिए, हम ऊतक के लिए एक माउस मॉडल विकसित किया है वातक भ्रष्टाचार आरोपण इंजीनियर । TETGs का निर्माण किया गया था electrospun पॉलिमर पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) और polyurethane (पु) के एक मिश्रण में पीईटी और पु (20:80 प्रतिशत वजन) । मचानों तो अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग 6-8 सप्ताह पुराने C57BL से अलग किया गया-ढाल केंद्रापसारक द्वारा चूहों भ्रष्टाचार प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं पाड़ के लुमेन पर बोये गए और तीसरे और सातवें वातक छल्ले के बीच आरोपण से पहले रातोंरात सेने की अनुमति दी । इन grafts एक प्रकार का रोग और विलंबित उपकला के निष्कर्षों के रूप में ऊतकीय विश्लेषण और केरातिन 5 और केरातिन 14 बेसल उपकला कोशिकाओं immunofluorescence पर की कमी के द्वारा प्रदर्शित करने में सक्षम थे । यह मॉडल सेलुलर और आणविक मेजबान remodeling में शामिल तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में काम करेंगे ।
Introduction
दीर्घ-खंड श्वाशलता दोष के रूप में दुर्लभ जन्मजात स्थितियों जैसे कि पूरी तरह से श्वाशलता के छल्ले और श्वासंतक आगेनेसिस, साथ ही आघात, द्रोह, और संक्रमण के रूप में पेश कर सकते हैं । जब वयस्कों में 6 सेमी या बच्चों में श्वासक लंबाई के 30% से अधिक है, इन दोषों सर्जिकल पुनर्निर्माण द्वारा इलाज नहीं किया जा सकता है । ऑटोलॉजिकल ऊतक, कैडेवेरिक प्रत्यारोपण, और कृत्रिम निर्माणों के साथ एयरवे को बदलने के प्रयास पुराने संक्रमण, कणिकायन, यांत्रिक विफलता, और स्टेनोसिस से ग्रस्त हो गए हैं ।
ऊतक इंजीनियर श्वासोत्तक grafts (TETGs) संभावित जीवन लंबे immunosuppression के लिए की जरूरत से परहेज करते हुए इन समस्याओं का पता कर सकते हैं. पिछले दशक में, tetgs पशु मॉडल में परीक्षण किया गया है और अनुकंपा के प्रयोग के दुर्लभ उदाहरणों में चिकित्सकीय उपयोग1,2,3। दोनों नैदानिक और बड़े पशुओं के अध्ययन में, ऊतक इंजीनियर airway प्रतिस्थापन से बाद ऑपरेटिव वसूली स्टेनोसिस से निपटने के लिए कई हस्तक्षेपों की आवश्यकता (> 50% luminal संकुचन के रूप में परिभाषित) और एयरवे पैटेंसी बनाए रखने के । अतिरिक्त tetg काम सेल बोने की पसंद, vascularization और पाड़ डिजाइन की भूमिका का मूल्यांकन के माध्यम से इस स्टेनोसिस को कम करने की मांग की है । सेल बोने के विकल्प और पाड़ डिजाइन देशी श्वासनली संरचना बहाल करने के उद्देश्य से/समारोह मुख्य रूप से श्वसन उपकला कोशिकाओं और विभिंन रिसोलुबल, गैर रिसोल्ड और decellularized मचानों पर बोये chondrocytes पर ध्यान केंद्रित किया गया है । के रूप में vascularization संभावना stenosis के विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, अंय समूहों विट्रो या विषमस्थानिक मॉडल में अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है revascularization या neoangiogenesis4में तेजी लाने के लिए । बहरहाल, सफल vascularization हासिल करते हुए भी एक यंत्रवत् सक्षम और कार्यात्मक TETG बनाए रखने के एक चुनौती बनी हुई है । हाल ही में अग्रिम के बावजूद, कम करने का रोग नैदानिक अनुवाद करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है ।
Vivo मेंtetg आरोपण करने के लिए इस histopathological प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, हम ऊतक के एक ovine मॉडल इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन विकसित की है । भ्रष्टाचार मिश्रित पॉलीथीन टेरेफ्थैलेट (पीईटी) और पॉलीयूरिथेन (पु) इलेक्ट्रोस्पन पाड़ से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-एमएनसी) से बना था । इस छोटे से सहगण में हमने यह दर्शाया है कि वरीयता प्राप्त ऑटोलॉजिस्ट बी एम एम-बहुराष्ट्रीय कंपनियों ने पुनः उपकला और विलंबित स्टेनोसिसमें तेजी लाई । हालांकि ऑटोलॉजिस्ट BM-MNCs के साथ सीडिंग अस्तित्व में सुधार, सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा BM-MNCs कार्यात्मक neotissue के गठन को मिलाना अस्पष्ट बनी हुई है ।
सेलुलर स्तर पर जांच ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के एक म्यूरिन मॉडल के विकास की आवश्यकता है । Ovine अध्ययन के लिए इसी प्रकार, हम एक पालतू पशु का उपयोग: पु electrospun पाड़ BM-mncs के साथ वरीयता प्राप्त ovine मॉडल के साथ संगत, tetg स्टेनोसिस पहले दो सप्ताह के दौरान आरोपण के बाद विकसित1,2,3 ,5. यह सुझाव दिया है कि म्यूरिन मॉडल पहले देखा विकृति को पुनः पूंजीकरण, हमें सक्षम करने के लिए आगे सेलुलर airway स्टेनोसिस अंतर्निहित तंत्र पूछताछ ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण (चित्रा 1, चित्रा 2) सहित माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के लिए हमारे प्रोटोकॉल ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक इंजीनियर tracheas के लिए एक माउस मॉडल का विकास TETGs के नैदानिक अनुवाद सीमित है कारकों को समझने में आवश्यक है; अर्थात भ्रष्टाचार पतन, स्टेनोसिस और विलंबित उपकला4. कुछ कारकों है कि इन सीमाओं के लिए यो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रॉबर्ट Strouse और अनुसंधान सूचना समाधान & राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में नवाचार प्रभाग ग्राफिक डिजाइन में उनके समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम एनआईएच (NHLBI K08HL138460) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
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