Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino
Summary
Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.
Abstract
Opciones de tratamiento para los defectos traqueal congénita o secundaria larga del segmento históricamente han limitado debido a una incapacidad para reemplazar tejido funcional. Ingeniería de tejidos es muy prometedor como una posible solución con su capacidad para integrar las células y moléculas de señalización en un andamio de 3 dimensiones. Trabajo reciente con ingeniería tisular traqueal injertos (TETGs) ha visto cierto éxito, pero su traducción ha estado limitada por la estenosis del injerto, injerto el colapso y retrasa la epitelización. Con el fin de investigar los mecanismos de conducción de estas cuestiones, hemos desarrollado un modelo de ratón para la implantación de prótesis traqueal de ingeniería tisular. TETGs fueron construidos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) y poliuretano (PU) en una mezcla de PET y PU (20:80 peso de por ciento). Andamios entonces fueron sembrados utilizando células mononucleares de médula ósea aisladas de 6-8 semanas-viejos ratones C57BL/6 por centrifugación del gradiente. 10 millones de células por injerto fueron sembradas en el lumen del andamio y permitir incubar durante la noche antes de la implantación entre el tercer y séptimo traqueal. Estos injertos eran capaces de recapitular los resultados de la estenosis y retrasa la epitelización según lo demostrado por análisis histológico y la falta de queratina 5 y 14 de queratina las células epiteliales basales en la inmunofluorescencia. Este modelo servirá como una herramienta para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la remodelación de la sede.
Introduction
Defectos traqueales de segmento largo se presentan como condiciones congénitas raras como anillos traqueales completos y agenesia traqueal, así como traumatismo, malignidad e infección. Cuando superior a 6 cm en adultos o 30% de la longitud traqueal en niños, estos defectos no pueden ser tratados por la reconstrucción quirúrgica. Intentos de sustituir las vías respiratorias con tejido autólogo, trasplante cadavérico y construcciones artificiales han sido plagados por infección crónica, granulación, falla mecánica y la estenosis.
Ingeniería tisular traqueales injertos (TETGs) potencialmente pueden abordar estos problemas, evitando la necesidad de inmunosupresión de por vida. En la última década, TETGs han sido probadas en modelos animales y utilizado clínicamente en raras ocasiones de uso compasivo1,2,3. En estudios animales tanto y grandes, recuperación postoperatoria de reemplazo de ingeniería tisular de la vía aérea requiere numerosas intervenciones a la estenosis de combate (definido como > enangostar luminal de 50%) y mantener la permeabilidad de las vías respiratorias. Trabajo adicional del TETG ha intentado reducir la estenosis a través de la evaluación de la función de célula siembra elección, vascularización y diseño de andamios. Andamio diseño dirigido a restaurar la tráquea nativa estructura/función y opciones de siembra de células se han enfocado principalmente en las células epiteliales respiratorias y condrocitos sembrados en varios andamios reabsorbibles y no reabsorbibles y decellularized. Como vascularización probablemente juega un papel importante en el desarrollo de estenosis, otros grupos se han centrado en optimizar en vitro o heterotópicos modelos para agilizar la revascularización o neoangiogenesis4. Sin embargo, lograr éxito vascularización manteniendo también un TETG mecánicamente competente y funcional sigue siendo un desafío. A pesar de los avances recientes, minimizando la estenosis sigue siendo un obstáculo crítico para la traducción clínica.
Para investigar la respuesta histopatológica a TETG implantación en vivo, hemos desarrollado un modelo ovino de ingeniería tisular reemplazo traqueal. El injerto fue compuesto de una mezcla de polietileno tereftalato (PET) y poliuretano andamio de electrospun (PU) sembrado con células mononucleares de médula ósea (BM-multinacionales). En esta cohorte pequeña, demostramos que empresas multinacionales BM autólogas sembradas aceleraron la reepitelización y retrasó estenosis5. Aunque la siembra con autólogo BM-multinacionales mejoradas la supervivencia, el mecanismo celular por el cual BM-MNCs modulan la formación de neotissue funcional sigue siendo confuso.
Investigación sobre el desarrollo requiere nivel celular de un modelo murino de tejido había diseñado reemplazo traqueal. Similar al estudio ovino, utilizamos un andamio de electrospun PET:PU con BM-MNCs. en concordancia con el modelo ovino, estenosis TETG desarrollado a lo largo de las dos primeras semanas tras la implantación1,2,3 ,5. Esto sugiere que el modelo murino recapituló la patología observada anteriormente, permitiéndonos además interrogar los mecanismos celulares subyacentes a la estenosis de la vía aérea.
En este informe, detallamos nuestro protocolo para ingeniería de tejidos reemplazo traqueal en el modelo de ratón incluyendo la fabricación de andamios, aislamiento BM-MNC, injerto siembra e implantación (figura 1, figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
El desarrollo de un modelo de ratón para traquear de ingeniería tisular es esencial en la comprensión de los factores que han limitado la traducción clínica de las TETGs; es decir, colapso del injerto, estenosis y epitelización retardada4. Algunos factores que contribuyen a estas limitaciones incluyen la selección del material de injerto, proceso de fabricación, diseño de andamio y célula siembra protocolos. Este modelo permite la más rápida evaluación de estos factores para entender …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría reconocer Robert Strouse y la división de innovaciones en el Hospital de niños en todo el país por su apoyo y soluciones de información de investigación en diseño gráfico. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (NHLBI K08HL138460).
Materials
| 0.9% Sodium chloride injection | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5in. Needle | BD | 305190 | |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25cc serological pipet | Falcon | 356535 | |
| 25G 1in. Needle | BD | 305125 | |
| 50cc tube | BD | 352070 | |
| Alcohol prep pads | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Baytril (enrofloxacin) solution | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Black polyamide monofilament suture, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6, female | Jackson laboratories | 664 | 6-8 weeks old |
| Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri retractors | F.S.T | 17000-04 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Rat anti-mouse antibody | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Fine scissors- Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand Premium Cover Glasses | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Fluoroshield Mounting Media with DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ibuprofen | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Iodine prep pads | Professional disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified | BioLegend | 905501 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Micro-Adson forceps | F.S.T | 11018-12 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Non-woven sponges | Covidien | 441401 | |
| Opthalmic ointment | Dechra Veterinary products | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU (Polyethylene terephthalate & Polyurethane) scaffolds | Nanofiber solutions | Custom ordered | |
| Petri dish | BD | 353003 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | F.S.T | 15008-08 | |
| Warm water recirculator | Gaymar | TP-700 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn animal health | NDC 59399-110-20 |
References
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