Induktion av läkemedelsinducerad, autoimmun hepatit hos BALB / c-möss för studier av dess patogena mekanismer
Summary
Vi beskriver en in vivo immunisering, translationell hepatitmodell hos BALB / c-möss som kan användas för att studera patogenesen av läkemedelsinducerad autoimmun hepatit inklusive könsskillnader som ses vid denna sjukdom. Vi kommer att beskriva hur denna modell visar reproducerbara analyser med hjälp av in vivo och in vitro experimentella tekniker.
Abstract
Läkemedelsinducerad autoimmun hepatit (DIH) är den vanligaste leverläkemedelsinducerade överkänslighetsprocessen som observerats hos cirka 9 till 12% av patienterna med autoimmun hepatit. Den överväldigande majoriteten av patienterna med DIH är kvinnor. De underliggande mekanismerna för dessa könsskillnader i prevalens är oklara på grund av bristen på djurmodeller som efterliknar mänsklig sjukdom. Trots det anses underliggande mekanismer allmänt vara associerade med humana leukocytantigenhaplotyper och könshormoner. Däremot har vi med hjälp av en DIH-musmodell avslöjat att IL-4-initierade CD4 + T-celler riktade mot en epitop av cytokrom P450 2E1 inducerar tillströmning av neutrofiler, makrofager och mastceller i levern hos kvinnliga BALB / c-möss. Med hjälp av denna modell har vi också visat att IL-33-inducerade FoxP3+regulatoriska T-celler ger skydd mot DIH hos hon- och hanmöss. Denna DIH-modell induceras genom att immunisera möss med en epitop av CYP2E1 som har förändrats kovalent med en läkemedelsmetabolit som har associerats med DIH. Denna epitop känns igen av patienter med DIH. Vår metod inducerar robust och reproducerbar hepatit och autoantikroppar som kan användas för att studera patogenesen av DIH. Medan in vivo-studier kan orsaka onödig smärta och nöd hos möss när de görs felaktigt, är fördelen med en in vivo-modell förmågan att utvärdera sjukdomspatogenesen hos ett stort antal möss. Dessutom kan biologiska effekter av de förändrade leverproteinerna studeras med invasiva procedurer. Tillägget av in vitro-studier till den experimentella designen möjliggör snabb upprepning och mekanistisk analys på cellnivå. Således kommer vi att demonstrera vårt modellprotokoll och hur det kan användas för att studera in vivo- och in vitro-mekanismer för DIH.
Introduction
Syftet med denna metod är att beskriva en musmodell av läkemedelsinducerad autoimmun hepatit som utvecklas in vivo och visa hur den kan användas för att undersöka den molekylära, immunologiska och genetiska grunden för denna sjukdom. Det långsiktiga målet med våra studier är att avslöja mekanismer som är ansvariga för utvecklingen av kronisk leverinflammation och skada genom att studera DIH hos mottagliga patienter. Leversjukdom och skrumplever utgör den sjätte vanligaste dödsorsaken hos vuxna mellan 25 och 64 år. Idiosynkratisk DILI, ibland kallad läkemedelsinducerad autoimmun hepatit (DIH) är den tredje vanligaste orsaken till akut leversvikt i USA. DIH är den vanligaste leverläkemedelsinducerade överkänslighetsprocessen som observerats hos cirka 9 till 12% av patienterna med autoimmun hepatit1. Den överväldigande majoriteten av patienterna med DIH är kvinnor 2,3,4. En typ av DIH utvecklas hos mottagliga individer efter administrering av halogenerade flyktiga anestetika såsom isofluran, sevofluran, desfluran eller halotan. Dessa anestetika binder kovalent till leverproteiner med reaktiva produkter av deras metabolism, vilket skapar nya autoantigener som kan framkalla allergiska eller autoimmuna svar5.
Studien av patogena mekanismer som är involverade i utvecklingen av bedövningsmedel och någon form av DIH har tidigare hindrats av bristen på en djurmodell som nära efterliknar induktionen av mänsklig sjukdom. Vi har utvecklat en experimentell murinmodell av DIH med funktioner som liknar immunmedierad DILI hos patienter. Hepatit induceras genom immunisering med en av två autoantigen som har modifierats kovalent av metaboliten trifluoracetylklorid (TFA) som bildas efter oxidativ metabolism av bedövningen av enzymet cytokrom P450 2E1 (CYP2E1)5. Ett autoantigen är den hepatiska cytosoliska S100-leverfraktionen, som är en blandning av flera proteiner6, och den andra autoanten är en epitop av CYP2E1 som känns igen av sera från patienter med bedövande immunmedierad DILI7. Genom att använda BALB/c-möss, som är relativt resistenta mot experimentell autoimmun hepatit, skiljer vi vår modell från den S100-inducerade immuniseringsmodellen av autoimmun hepatit hos C57Bl/6J-möss8.
På grund av dess olika kliniska presentationer är DIH svårt att studera hos patienter. Translationella experimentella modeller erbjuder förmågan att utvärdera patogenesen av sjukdom in vivo och in vitro. För närvarande finns det inga andra alternativa metoder för att inducera digitala innovationsknutpunkter som fullständigt undersöker adaptiva eller medfödda immunsvar in vivo eller in vitro utan användning av djur. Dessutom, eftersom trifluoracetylering av S-100 eller CYP2E1-epitopen inte verkar producera ett irriterande immunogen, och vi inducerar DIH genom immunisering med TFA-förändrade proteiner, kommer dessa djur inte att få eter, något halogenerat bedövningsmedel, barbiturat eller alkohol före immunisering eller andra förfaranden, med tanke på att dessa medel kan förändra parametrarna vi studerar. Trots det har vi minskat vår musanvändning genom att använda datorsimulering för att bekräfta bindningspreferenserna för vår upptäckta CYP2E1-epitop9 och har speglat mänsklig DIH som involverar kvinnligt kön genom att visa att kvinnliga BALB / c-möss utvecklar en svårare DIH10.
Trots olika presentationer av DIH hos patienter och utmaningar i studien av klinisk sjukdom är post-translationell modifiering av inhemska proteiner med reaktiva läkemedelsmetaboliter en accepterad nyckelmekanism i patogenesen DIH som följer halogenerade anestetika11. Utredarna accepterar också att CYP2E1 är ett viktigt autoantigen i denna process 12,13. Rollen av interleukin (IL) -4-uppreglerade CD4 + T-celler som känner igen en post-translationellt modifierad CYP2E1 och andra leverproteiner är en accepterad initiativtagare till anestetisk DIH genom att locka neutrofiler, eosinofiler och mastceller i levern14, och denna mekanism har bekräftats i många former av DIH15,16. Inducerade FoxP3-uttryckande CD4 + CD25 + T-celler (Tregs) minskar svårighetsgraden av DIH, och relativa brister hos dessa celler i mjälten förvärrar DIH 10,7. Således har majoriteten av framstegen när det gäller att förstå DIH möjliggjorts genom att använda in vivo-musmodeller för att utvärdera de genetiska, metaboliska och immunologiska mekanismerna för DIH både in vivo och in vitro.
Eftersom vi och andra utredare har avslöjat roller för IL-4, neutrofiler och eosinofiler vid initiering av DIH med olika musmodeller, tror vi att denna observation stöder vårt påstående att oavsett vilken DIH-modell som används, induceras hepatit och skada av IL-4. Styrkan i vårt protokoll ligger i användningen av in vivo-metodik, både manliga och kvinnliga möss, och upprepning av histologi, CD4 + T-cellproliferationsanalyser och cytokiner. Styrkan i vår användning av in vitro-studier är att de minskar antalet möss som behövs samtidigt som de tillhandahåller metoden för att isolera cellulära interaktioner som driver DIH. Vi rekommenderar användning av han- och honmöss eftersom detta minskar risken för omedveten bias vid tolkning av resultat och stärker översättningspotentialen i våra studier eftersom förekomsten, prevalensen och svårighetsgraden av DIH är högre hos kvinnor17. Vi rekommenderar att möss erhålls från en enda leverantör; men om detta inte är möjligt, skaffa kullkompiskontroller eller vildtypsmöss från samma leverantör som de genetiskt förändrade mössen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Styrkan i detta protokoll ligger i dess reproducerbarhet; så det är viktigt att följa de föreslagna stegen. Formulering av immunogen kan vara en barriär för vissa; Vi har dock reproducerat vår modell med hjälp av epitopen som beskrivs i vårt dokument, vilket tar bort behovet av att isolera S100-fraktionen av levern. Det är troligt att ytterligare epitoper eller proteiner kan förändras och inducera hepatit efter immuniseringar; vi beskriver dock de proteiner som vi har använt med tillförlitliga resultat. Fle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Njoku vill erkänna Dr. Noel R. Rose, MD PhD, för hans vägledning och insiktsfulla diskussioner som resulterade i formuleringen av denna modell.
Materials
| 0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) | ThermoFisher | 28997 | |
| AKP Substrate Kit | BioRad | 172-1063 | |
| BALB/c mice | Jackson | ||
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34554 | |
| CFA H37Ra | Becton Dickinson (Difco Bacto) | 231131 | |
| FcR Blocking reagent | Milteyi | 130-092-575 | |
| General supplement | ThermoFisher | HPRG770 | |
| HepaRG™ cells cryopreserved | ThermoFisher | HPR GC10 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit | ThermoFisher | L34965 | |
| NaHC03 | Millipore Sigma | S5761 | |
| Percoll® | Millipore Sigma | P1644-1L | |
| Pertussis Toxin | List Biologicals | 180 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Various | ||
| Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free | ThermoFisher | 88666 | |
| Potassium Hydroxide | JT Baker | 3140-01 | |
| S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA) | Millipore Sigma | 177474 | |
| Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml) | ThermoFisher | 66810 | |
| UltraPure™ SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 | |
| Williams Media E, no phenol red | ThermoFisher | A1217601 |
References
- Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
- Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
- Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
- Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
- Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
- Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
- Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
- Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
- McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
- Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
- Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
- Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
- Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
- Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
- Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
- Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
- Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
- Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
- Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
- Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
- Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).
