Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain
Summary
Nous présentons ici une levure améliorée hybride un filtrage de protocole afin d’identifier les facteurs de transcription (TFs) qui peuvent se lier à une région d’ADN humaine d’intérêt. Cette méthode utilise un pipeline de criblage à haut débit qui peut interroger la liaison de > 1 000 TFs dans une expérience simple.
Abstract
Identifier les ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui régissent chaque gène humain est une tâche ardue qui nécessite l’intégration de nombreuses approches expérimentales et informatiques. Une de ces méthodes est l’essai (Y1H) un hybride de levure, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes rapporteurs. Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (par exemple., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » qui peut être projetée pour l’activation du gène rapporteur. Plus les protocoles publiés pour l’exécution de Y1H écrans sont basées sur la transformation des bibliothèques TF-proies ou des tableaux dans les souches de levures ADN-appât. Ici, nous décrivons une canalisation, appelée Y1H améliorée (eY1H) essais, où les interactions ADN-TF sont interrogées par l’accouplement d’ADN-appât souches avec une collection déployèrent de souches de TF-proies à l’aide d’une matrice haute densité plate-forme de robotique (HDA) qui permet le dépistage dans un 1 536 format de la colonie. Ce qui permet une augmentation dramatique du débit (60 séquences ADN-appâts contre > 1 000 TFs prend deux semaines par chercheur) et reproductibilité. Nous illustrons les différents types de résultats escomptés en testant les séquences promoteur humain contre un tableau de 1 086 TFs humaines, ainsi que des exemples des problèmes qui peuvent survenir pendant les écrans et comment les résoudre.
Introduction
Un problème central dans le domaine biomédical consiste à déterminer les mécanismes par lequel chaque gène humain est réglementé. La transcription est la première étape dans le contrôle des niveaux d’expression de gène, et elle est régulée par des ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui sont uniques à chaque gène. Étant donné que les humains codent pour > 1 500 TFs1,2, identifier l’ensemble des TFs qui contrôlent l’expression de chaque gène reste un défi ouvert.
Deux types de méthodes permet de mapper des interactions ADN-TF : méthodes TF-centrée et axée sur l’ADN3 (Figure 1 a). Dans les méthodes axées sur la TF, TF d’intérêt est sondé pour lier à des régions d’ADN génomiques ou pour déterminer sa spécificité de liaison de l’ADN. Ces méthodes incluent immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie de séquençage haut-débit, protéine liant microarrays et SELEX4,5,6. Dans les méthodes axées sur l’ADN, une séquence d’ADN d’intérêt est sondée pour déterminer l’ensemble des TFs qui se lient à la séquence d’ADN. La plus largement appliquée de telles méthodes est essais (Y1H) de levure un hybride, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes de journaliste pour7,8,9.
Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (p. ex., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » ce qui peut être projetée pour le journaliste gene activation9,10 (Figure 1 b). L’ADN-appât est cloné en amont du reporter deux gènes (LacZ et HIS3) et les deux constructions de DNA-bait::reporter sont intégrées dans le génome de la levure pour générer des chromatinized « ADN-appât souches. » La TF-proie, encodée dans un plasmide qui exprime une TF fusionné au domaine d’activation (AD) de la levure Gal4 TF, est introduite dans la souche ADN-appât pour pêcher des interactions ADN-TF. Si la TF-proie se lie à la séquence de l’ADN-appât, puis l’annonce présente dans la TF-proie entraînera l’activation de ces deux gènes rapporteurs. Ainsi, les cellules avec une interaction positive peuvent être sélectionnés pour la croissance sur plaques manque histidine, mais aussi de surmonter un inhibiteur compétitif, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT) et visualisées comme colonies bleues en présence de le X-gal. Parce que la levure puissante Gal4 AD est utilisé, Y1H essais peuvent détecter des interactions impliquant des activateurs de la transcriptionnelles, mais aussi des répresseurs. En outre, étant donné que TF-proies sont exprimés à partir d’un promoteur fort levure (ADH1), des interactions peuvent être détectées même pour TFs qui ont des niveaux de faible expression endogènes, qui sont difficiles à détecter par puce11,12.
Plus les protocoles publiés pour effectuer des essais de Y1H reposent sur introduction TF-proies dans les souches de levure ADN-appât en transformant regroupées TF-proie bibliothèques, suivies par la sélection, la colonie cueillette et séquençage d’identifier l’interaction TF ou par transformer des clones8,9. Voici les protocoles chronophages, limitant le nombre de séquences d’ADN qui peuvent être testés par chercheur. Une amélioration récente des essais de Y1H, appelé enhanced Y1H (eY1H), a considérablement accru le débit de dépistage à l’aide d’une plateforme robotique de haute densité (HDA) de tableau se pour accoupler des souches de levures ADN-appât avec une collection de souches de levures, chacune exprimant un autre TF-proie10,13 (Figure 1). Ces écrans emploient une colonie 1 536 format permettant de tester TFs plus humaines en quatre exemplaires, à l’aide de seulement trois besants. En outre, étant donné que les interactions ADN-TF sont analysées d’une manière par paires, cette approche permet de comparer les interactions entre l’ADN-appâts (par exemple, deux variantes de nucléotides non codantes) et entre différents TFs ou TF variantes11,12 ,,14.
Utilisant l’eY1H, nous avons délimité l’homme plus grand et Caenorhabditis elegans TF-ADN ADN-centrée interactions entre réseaux à ce jour. En particulier, nous avons identifié 2 230 interactions entre 246 exhausteurs de développement humains et 283 TFs12. En outre, nous avons utilisé des épreuves d’eY1H pour découvrir la liaison TF modifiée à 109 variantes non codantes nucléotide, associées à des maladies génétiques telles que la malformation du développement, le cancer et des troubles neurologiques. Plus récemment, nous avons utilisé eY1H pour délimiter un réseau comprenant 21 714 interactions entre 2 576 promoteurs de gènes de c. elegans et 366 TFs11. Ce réseau a contribué à révéler le rôle fonctionnel de dizaines de c. elegans TFs.
Les protocoles pour générer des taches de l’ADN-appâts et évaluer les niveaux d’activité de journaliste de fond ont été signalés ailleurs15,16,17. Nous décrivons ici un pipeline eY1H qui peut être utilisé pour n’importe quelle région d’ADN génomique humaine contre un tableau de 1 086 TFs humaines de l’écran. Une fois une levure souche ADN-appât est générée et un tableau de TF-proies est repéré sur les plaques correspondantes, l’ensemble du protocole peut être effectué en deux semaines (tableau 1). Plus important encore, le protocole peut être parallélisé afin qu’un seul chercheur peut dépister 60 séquences ADN-appât en même temps. Pour illustrer le protocole, les auteurs ont criblé les promoteurs des deux gènes de cytokines CCL15 et IL17F. En outre, nous montrons résultats à partir des écrans ayant échouées pour illustrer les types de problèmes qui peuvent survenir lors de l’exécution des essais eY1H et comment les résoudre.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche de dépistage accouplement eY1H robotique décrit ici grandement augmente le débit afin d’identifier l’ensemble des TFs qui se lient à une région d’intérêt, par rapport à la précédente projection de bibliothèque ou approches de dépistage déployèrent basées sur la transformation de l’ADN. En outre, les interactions ADN-TF détectées par eY1H les dosages sont hautement reproductibles comme 90 % des interactions détectées sont positifs pour tous les quatre colonies testées par TF, et 90…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [R35-GM128625 à J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
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