Her presenterer vi en forbedret gjær ett-hybrid screening protokoll for å identifisere transkripsjonsfaktorer (TFs) som kan binde til et menneskelig DNA område av interesse. Denne metoden bruker en høy gjennomstrømming screening rørledningen som kan forhøre binding av > 1000 TFs i et enkelt eksperiment.
Identifisere settene med transkripsjonsfaktorer (TFs) som regulerer hver menneskelig genet er en skremmende oppgave som krever integrere mange eksperimentelle og computational tilnærminger. En slik metode er gjær en-hybrid (Y1H) analysen, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener. Y1H analyser omfatter to komponenter: en ‘DNA-agn’ (f.eks., arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en ‘TF-byttedyr,”som kan bli vist for reporter genet aktivisering. Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H skjermer er basert på transformere TF-byttedyr biblioteker eller matriser til DNA-agn gjær påkjenningen. Her beskriver vi en rørledning, kalt utvidet Y1H (eY1H) søk, hvor TF-DNA interaksjoner er avhørt av parring DNA-agn stammer med en plassert samling av TF-byttedyr stammer med en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform som gjør at screening i en 1,536 kolonien format. Dette gir en dramatisk økning i ytelse (60 DNA-agn sekvenser mot > 1000 TFs tar to uker per forsker) og reproduserbarhet. Vi illustrerer ulike forventede resultater av tester menneskelig promoter sekvenser mot en rekke 1,086 menneskelige TFs, samt eksempler på problemer som kan oppstå under skjermer og feilsøke dem.
Et sentralt problem innen biomedisinsk bestemmer mekanismer som hver menneskelig genet er regulert. Transkripsjon er første skritt i å kontrollere gene expression nivåer, og det er regulert av sett med transkripsjonsfaktorer (TFs) som er unike for hver genet. Gitt at mennesker kode > 1500 TFs1,2, identifisere det fullstendige sett av TFs som kontrollerer uttrykk for hver genet er fortsatt et åpent utfordring.
To typer metoder kan brukes til TF-DNA interaksjoner: TF-sentrert og DNA-sentrert3 (figur 1A). I TF-sentrert metoder, er en TF rundt undersøkt for bindingen genomisk DNA regioner eller bestemme sin DNA bindende spesifisitet. Disse metodene omfatter chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming sekvensering, protein bindende microarrays og SELEX4,5,6. I DNA-sentrert metoder, er en DNA sekvens av interesse analysert for å fastslå hvilke TFs som binder til DNA sekvensen. Den mest brukte av slike metoder er gjær en-hybrid (Y1H) analyser, i hvilken interaksjoner mellom TFs og DNA områder er testet i miljøet gjær kjernen bruker reporter gener7,8,9.
Y1H analyser omfatter to komponenter: en ‘DNA-agn’ (f.eks arrangører, enhancers, lyddempere, etc.) og en ‘TF-byttedyr,”som kan bli vist for reporter genet aktivisering9,10 (figur 1B). DNA-agn er klonet oppstrøms av to reporter gener (LacZ og HIS3) og begge DNA-bait::reporter konstruksjoner er integrert i gjær genomet til å generere chromatinized ‘DNA-agn stammer.” TF-byttet, kodet i en plasmider som uttrykker en TF smeltet aktivisering domenet (AD) av gjær Gal4 TF, er introdusert i DNA-agn belastningen fiske for TF-DNA interaksjoner. Hvis TF-byttet binder til DNA-agn sekvensen, vil Annonsen i TF-byttet føre til aktivering av både reporter gener. Celler med en positiv vekselvirkningen kan derfor valgt for vekst på platene mangler histidin, i tillegg til å overvinne en konkurransedyktig inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), og visualisert som blå kolonier i nærvær av X-gal. Fordi potente gjær Gal4 AD brukes, Y1H analyser kan oppdage samhandlinger med transcriptional aktivator samt repressors. Gitt at TF-preys uttrykkes fra en sterk gjær promoter (ADH1), kan i tillegg interaksjoner oppdages for TFs som har lav endogene uttrykk nivåer som er vanskelig for å oppdage ved ChIP11,12.
Mest publiserte protokoller for å utføre Y1H analyser er basert på presenterer TF-preys i gjær DNA-agn påkjenningen av transformere gruppert TF-byttedyr biblioteker etterfulgt av valg og kolonien plukke sekvensering å identifisere samspill TF, eller ved transformere personlige kloner8,9. Dette er tidkrevende protokoller, begrense antall DNA-sekvenser som kan testes per forsker. En siste forbedring av Y1H analyser, kalt utvidet Y1H (eY1H), har dramatisk økt screening gjennomstrømningen ved hjelp av en høy tetthet matrise (HDA) robot plattform for å mate DNA-agn gjærstammer med en samling av gjær påkjenningen hver uttrykker en annen TF-byttedyr10,13 (figur 1 c). Disse skjermene ansette en 1536 kolonien format tillater å teste de fleste mennesker TFs i quadruplicate bruker bare tre plater. Videre, gitt at TF-DNA interaksjoner er testet på en parvis måte, dette gir sammenligne interaksjoner mellom DNA-agn (for eksempel to noncoding single nukleotid varianter) og mellom ulike TFs eller TF varianter11,12 ,14.
Bruker eY1H analyser, har vi vært største menneskelige og Caenorhabditis elegans DNA-sentrert TF-DNA interaksjoner nettverk hittil. Spesielt har vi identifisert 2.230 vekselsvirkningene mellom 246 menneskelige utviklingsmessige enhancers og 283 TFs12. Videre har vi ansatt eY1H analyser å avdekke endret TF binding til 109 single nukleotid noncoding varianter knyttet til genetiske sykdommer som utviklingsmessige misdannelse, kreft og nevrologiske lidelser. Nylig brukte vi eY1H til å avgrense et nettverk bestående av 21,714 vekselsvirkningene mellom 2576 C. elegans genet arrangører og 366 TFs11. Dette nettverket var å avdekke funksjonelle rolle dusinvis av C. elegans TFs.
Protokollene å generere DNA-agn flekker og evaluere nivåer av bakgrunnen reporter aktivitet har vært rapportert andre steder15,16,17. Her beskriver vi en eY1H rørledning som kan brukes til skjermen noen menneskelige genomisk DNA regionen mot en rekke 1,086 menneskelige TFs. Når en gjær DNA-agn belastning genereres og en TF-byttedyr matrise er oppdaget på de tilsvarende platene, kan hele protokollen utføres i to uker (tabell 1). Enda viktigere, kan protokollen være parallelized slik at en enkelt forsker kan skjermen 60 DNA-agn sekvenser samtidig. For å demonstrere protokollen, vist vi arrangørene av to cytokin gener CCL15 og IL17F. I tillegg, viser vi resultater fra mislykkede skjermer for å illustrere hvilke typer problemer som kan oppstå når eY1H analyser og feilsøke dem.
Robot eY1H parring screening tilnærming beskrevet her sterkt øker for å identifisere settet med TFs som binder til et DNA område av interesse, sammenlignet med tidligere biblioteket screening eller plassert screening tilnærminger basert på transformasjon. Videre, de TF-DNA interaksjonene oppdaget av eY1H analyser er svært reproduserbare som 90% av interaksjoner oppdaget er positivt for alle fire kolonier testet per TF og 90% av interaksjoner Omtest i en uavhengig skjerm av samme gjær DNA-agn belastning<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35-GM128625 å J.I.F.B.].
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |